Plaque Assay

Plaque Assayta voidaan käyttää klonaalisen viruspopulaation puhdistamiseen tai virustitterin määrittämiseen plakkeja muodostavina yksikköinä millilitrassa (pfu/ml), jotta tunnettuja määriä virusta voidaan käyttää solujen infektoimiseen myöhemmässä työssä. Tässä määrityksessä solumonolyyrit infektoidaan pienellä virussuhteella siten, että satunnaiset solut infektoituvat. Agaroosipeite pitää solut stabiilina ja rajoittaa viruksen leviämistä. Kun jokainen infektoitunut solu tuottaa virusta ja lopulta lysoituu, vain välittömästi viereiset solut saavat tartunnan. Kutakin tartunnan saaneiden solujen ryhmää kutsutaan plakiksi. Tarttumattomat solut ympäröivät plakkeja. Useiden infektiosyklien jälkeen plakkien keskellä olevat infektoituneet solut alkavat lyysaantua, ja reunimmaiset infektoituneet solut jäävät infektoitumattomien solujen ympäröimiksi. Tämä ilmiö aiheuttaa sen, että infektoituneiden solujen läpi kulkeva valo taittuu eri tavalla kuin ympäröivät infektoitumattomat solut, ja plakki voidaan havaita joko paljain silmin tai valomikroskoopilla. Kukin plakki edustaa yhtä virusta. Siksi klooniset viruspopulaatiot voidaan puhdistaa eristämällä yksittäisiä plakkeja. Viruskannan eri laimennoksista saadut yksittäiset plakit voidaan laskea tietyn transfektion tai viruskannan virustitterin (pfu/ml) määrittämiseksi. Solujen kunto ja niiden tasainen jakautuminen kudosviljelylevyn pinnalle on tärkeää plakkimäärityksen onnistumisen kannalta. Solujen on oltava terveitä, > 95-prosenttisesti elinkelpoisia ja logfaasikasvussa määrityshetkellä. Möhkäleiset solut, solut, jotka eivät ole jakautuneet tasaisesti oikeaan tiheyteen (> 70 %) levylle, ja solut, jotka eivät tartu kudosviljelymaljoille 30 minuutin kuluessa istutuksesta, haittaavat määritystä.

Tarvittavat lisämateriaalit:

Plaque Assay Agarose, Cat. No. 554766
Grace’s Unsupplemented Insect Cell Medium
Fetal Bovine Serum
Kudosviljelymalja, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Cat. No. 353802
42 °C:n vesihaute

Protokolla

Määritä tarvittavien levyjen määrä

Kullekin yhteistransfektio- tai viruskannalle (ja positiiviselle kontrollille) tehdään kaksoiskappaleet sarjalaimennoksista (10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ). Merkitse kukin 60 mm:n levy näytteen ja laimennoksen kuvauksilla.

Kylvä viljelylevy hyönteissoluilla

1. Kylvä 2,3 x 10 6 Sf9-solua jokaiselle 60 mm:n levylle. Keinuta levyjä varovasti edestakaisin ja sitten puolelta toiselle, jotta solut jakautuvat tasaisesti levyn pinnalle. Älä koskaan pyöritä levyä; tämä aiheuttaa solujen epätasaista jakautumista. Kun levyt on kylvetty, anna solujen tarttua 30 minuutista tuntiin. Valmistele tänä aikana agariliuos ja viruslaimennokset. Visualisoi valomikroskoopilla varmistaaksesi >70 %:n konfluenssi ja solujen tasainen jakautuminen.

Valmista agaroosiliuos

Levytetyt solut peitetään 1 %:n agaroosiliuoksella, joka on Gracen hyönteissolujen elatusaineessa, jota on täydennetty 10 %:lla FBS:llä.

1. Varmista ensiksi vesihauteen lämpötila 42 °C:een. Määritä tarvittavan agariliuoksen kokonaistilavuus: kerro 4 ml/levy plakkikokeiden määrällä. Tästä kokonaistilavuudesta puolet on autoklavoitua dH 2 O + agaroosia 2-prosenttisen liuoksen aikaansaamiseksi ja toinen puoli Gracen hyönteismediaa, jota on täydennetty 10 % FBS:llä. Määrittääksesi lopullisen 1 %:n agaroosiliuoksen valmistamiseen tarvittavan plakkimääritysagaroosin määrän grammoina kerrotaan kokonaistilavuus 0,01:llä. (Esimerkiksi 10 levyä x 4 ml = 40 ml. 40 ml X 0,01 = 0,4 g.)
2. Lisää sopiva määrä autoklavoitua dH 2 O:ta sopivan kokoiseen steriiliin lasipulloon. Seuraavaksi lisätään hitaasti laskettu määrä agaroosia samalla varovasti pyörittäen dH 2 O:n ja agaroosin sekoittamiseksi. Laita seos mikroaaltouuniin, kunnes se juuri ja juuri kiehuu. Poista pullo ja tarkista seos liukenemattoman agaroosin varalta. Jos sitä on, jatketaan kuumentamista. Toista, kunnes agaroosi on täysin liuennut (VAROITUS: seos ja sen mukana tuleva höyry ovat erittäin kuumia ja voivat polttaa. Käytä asianmukaisia suojavarusteita/varotoimenpiteitä). Kun agaroosi on täysin liuennut, korkki suljetaan löysästi ja pullo siirretään 42 °C:n vesihauteeseen. Anna seoksen jäähtyä 42 °C:seen.
3. Huolehdi Grace’s Insect Media ja lisää Fetal Bovine Serum 10 %:iin. Esimerkki: 100 ml:aan Grace’s Insect Mediaa lisätään 10 ml FBS:ää. Aseta Grace’s media + 10 % FBS -seos 42 °C:n vesihauteeseen.

Valmista viruksen sarjalaimennokset

1. Merkitse kutakin yhteistransfektiota varten kuusi 15 ml:n steriiliä 15 ml:n putkea 10 -1:stä 10 -6:een asianmukaisella näytteen kuvauksella. Lisää jokaiseen putkeen 2,7 ml TNM-FH-mediaa. Lisää 0,3 ml ko-transfektiosupernatanttia ensimmäiseen putkeen, vortex-putki. Suorita sarjalaimennukset siirtämällä 0,3 ml seuraavaan laimennokseen käyttäen joka kerta uutta pipettiä.

Infektoi yksikerroksiset solut

1. Tässä vaiheessa soluilla on ollut riittävästi aikaa tarttua levyn pintaan. Tarkista useat levyt valomikroskoopilla varmistaaksesi 70 %:n konfluenssi ja solujen tasainen jakautuminen.
2. Työskentele kunkin laimennoksen duplikaattilevyjen kanssa ja imuroi varovasti väliaine pois soluista käyttämällä steriiliä 200 µl:n pipettikärkeä ja tyhjiötä. Älä häiritse solulevyä. Lisätään 1 ml sopivaa viruslaimennosta kumpaankin kaksoismallilevyyn ja heilutetaan levyä varovasti edestakaisin ja sitten sivulta toiselle, jotta virus jakautuu tasaisesti. Toista tämä kaikilla vastaavilla levyillä ja laimennoksilla.
3. Keinuta levyjä varovasti huoneenlämmössä, steriilissä hupussa 15 minuutin välein 1 tunnin ajan.

Peittele infektoidut solut agaroosilla

1. Varmista 1 tunnin kuluttua, että agaroosiliuos on 42 °C:ssa. Liuoksen pitäisi olla tarpeeksi lämmintä, jotta se on vielä nestemäisessä tilassa, mutta sen pitäisi olla tarpeeksi viileää, jotta sitä voi pitää kädessä. Jos pulloa ei voi pitää mukavasti kädessä, liuos on liian kuuma ja tappaa Sf9-solut. Varmista, että Grace’s Insect Media w/ 10% FBS on 42 °C:n lämpötilassa. Jos näin on, lisää sama määrä agaroosiliuokseen, jotta lopullinen agariliuos on valmis. Sekoita lopullinen agariliuos hyvin.
2. Kun liuos on valmis, aseta se lasiseen dekantterilasiin, joka on täytetty vesihauteen vedellä. Tämän pitäisi estää liuosta jähmettymästä, kun käytät sitä hupun alla. Tarkista toimenpiteen aikana ajoittain dekantterilasissa olevan veden lämpötila. Jos se alkaa jäähtyä, vaihda se lämpimään veteen vesihauteesta.
3. Työskennellessäsi yhden kaksoiskappaleen parin kanssa kerrallaan imuroi varovasti väliaine pois soluista käyttämällä steriiliä 200 µl:n pipettikärkeä ja tyhjiötä. Älä hajota solulevyä. Kallista levyä hieman aspiroinnin aikana ja imuroi supernatantti levyn reunasta. Tämä mahdollistaa optimaalisen imuroinnin häiritsemättä solukalvoa. Lisää sen jälkeen hitaasti 4 ml agariliuosta jokaiselle levylle ja anna agarin jähmettyä.
4. Kun kaikkien levyjen agar on jähmettynyt, aseta levyt varovasti puhtaaseen, ilmatiiviiseen inkubaatiokammioon. Kostuta kammio asettamalla steriili sideharso ja 10 ml steriiliä vettä 10 mm:n kasvatusmaljaan inkubointikammion pohjatelineeseen. Sulje kammio ja aseta se 27 °C:n inkubaattoriin. Anna levyjen inkuboitua 6-10 päivää.
5. Levyt voidaan visualisoida kääntämällä levyt tummalle taustalle ja valaisemalla niitä voimakkaalla valonlähteellä levyn sivulta tai pitämällä niitä 45° kulmassa valonlähteeseen. Kun opettelet tunnistamaan plakkeja, ympyröi mahdolliset plakit markkerilla. Visualisoi valomikroskoopilla pienellä teholla varmistaaksesi, että solunurmikossa on kirkas alue. Visualisoi suurella teholla etsiäksesi infektoituneita soluja kirkastuman reuna-alueelta ja sitten vähemmän infektoituneita soluja siirryttäessäsi poispäin kirkastuma-alueelta.
6. Plakkien visualisoinnin helpottamiseksi peitä 3 ml:lla 0,5-prosenttista agaroosia (joka on valmistettu aiemmin kuvattujen ohjeiden mukaisesti), joka sisältää neutraalipuna-ainetta 50 µg/ml (valmista neutraalipuna-aineliuoksen (Sigma N7005) kantaliuosta, jonka pitoisuus on 1 mg/ml vedessä tai PBS-ratkaisuveteen. Steriloidaan suodattimella ja säilytetään 4 °C:ssa pimeässä). Anna kovettua ja inkuboi levyä yön yli 27 °C:ssa. Neutraalipuna värjää terveet solut ja plakit näkyvät kirkkaina alueina, joiden halkaisija on noin 0,5-3 mm valkoista taustaa vasten. Koska neutraalipunainen on elintärkeä väriaine, on tärkeää värjätä, kun solumonokerros on terve, ts. 4-7 päivää infektion jälkeen.

Plakkien puhdistaminen viruskannasta

Kunnollisen eristyksen varmistamiseksi plakit on parasta poimia levyiltä, jotka sisältävät alle 50 plakkia. Levytetään useita laimennoksia viruksesta, jotta varmistetaan, että saadaan riittävän pieni määrä plakkeja. Plakit voidaan poimia käyttämällä steriilejä mikropipettikärkiä (1 000 µl) tai mikrokapillaariputkia.

Viruksen monistaminen plakkien poiminnasta

1. Merkitse plakin alla oleva levy merkkiaineella. Poista steriilillä pipetin kärjellä agaroositulppa suoraan plakin päälle. Poimi tällä tavoin 10-100 plakkia.
2. Aseta kukin agaroositulppa erilliseen mikrosentrifugiputkeen, joka sisältää 1 ml kudosviljelyalustaa. Huuhtele viruspartikkelit pois agaroosista pyörittämällä putkea yön yli 4 °C:ssa.
3. Lisää 200 µl kutakin plakkipoimua 12-kuoppaisen kudosviljelylevyn erillisiin kuoppiin, joihin on kylvetty 2 x 10 5 solua kuoppaa kohti 1 ml:aan tuoretta TNM-FH-mediaa. Inkuboi levyjä 3 päivän ajan 27 °C:ssa.
4. Tämän läpikäynti-yksi-kannan viruksen supernatantti voidaan kerätä ja sentrifugoida 5 minuutin ajan 1 000 x g:ssa 4 °C:ssa roskien poistamiseksi. Säilytetään 4 °C:ssa.
5. Siemennys 100 mm:n kudosviljelylevylle 5 x 10 6 solulla kutakin plakki-isolaattia kohti. Anna solujen kiinnittyä ja vaihda väliaine 10 ml:lla tuoretta TNM-FH-mediaa.
6. Lisää 200 µl läpikulku-yksi-kantaa 100 mm:n levylle ja inkuboi 27 °C:ssa 4 päivän ajan. Säästä loput 800 µl passage-one-kantaa 4 °C:ssa varmuusvarastoksi.
7. Korjaa viruksen supernatantti ja sentrifugoi roskien poistamiseksi. Määritä tämän passage-kakkosvaraston titteri. Jos titteri jää alle 2 x 10 8 pfu/ml, siirry bakuloviruksen monistamiseen.