Abstract
Nestekromatografiaa yhdistettynä massaspektrometriaan (LC-MS) on käytetty laajalti perinteisen kiinalaisen lääketieteen (TCM) tutkimuksessa, kun monimutkaisten näytteiden erottelu ja tuntemattomien materiaalien havaitsemisominaisuudet ovat parantuneet. Tässä artikkelissa kuvataan nestekromatografian (LC) ja massaspektrometrian (MS) periaatteita sekä niiden etuja ja haittoja TCM:n laadullisessa ja määrällisessä analysoinnissa. Haimme tutkimuskirjallisuutta LC-MS:n soveltamisesta TCM:ssä, joka on julkaistu viimeisten viiden vuoden aikana kotimaassa ja ulkomailla. Jotta TCM:n analyysia voitaisiin ohjata paremmin, tässä katsauksessa keskitytään pääasiassa LC-MS:n sovelluskategoriaan, siihen, kuinka usein erilaisia LC-MS:iä käytetään, sekä erilaisten LC-MS:ien laadulliseen ja määrälliseen kykyyn TCM:n tutkimuksessa.
1. Johdanto
Tuhansien vuosien aikana esi-isiemme keräämä kokemus elämästä ja sairauksista on lopulta käännetty nykyaikaiseksi apteekiksi. Kiinalaiset yrtit, joissa on monimutkaisia ja erilaisia ainesosia, pannaan yleensä käytäntöön reseptillä noudattaen monarkin, ministerin, avustajan ja oppaan sääntöjä. Käytettäessä yksittäisten yrttien ja farmaseuttisten valmisteiden määrä voi vaihdella, mikä voi johtaa muutoksiin lääkkeiden ja vaikuttavan aineen välisessä vuorovaikutuksessa. Eri lääkkeiden käyttöpaikoissa ainesosissa on eroja. TCM:n kemiallisen koostumuksen monimutkaisuuden vuoksi erilaiset kemialliset koostumukset voivat myös reagoida keskenään. Vaikka käytännön soveltaminen on osoittanut TCM:n tehokkuuden, on edelleen vaikeaa selittää TCM:n erityisiä lääkeaktiivisia ainesosia nykyaikaisessa tieteessä. Viime vuosina yhdisteen in vivo -metaboliasta ja vaikutusmekanismista on tullut kuuma kiinalaisen lääketieteen tutkimusaihe. Mutta sen ominaisuudet, kuten monimutkainen koostumus, monikohde- ja monitoimimekanismi ja ainesosien rooli, antavat TCM: n tutkimukselle tietyn vaikeusasteen.
LC-MS integroi täysin LC-näytteen korkean erotuskapasiteetin monimutkaisille näytteille ja MS: n vahvan laadullisen kyvyn . Korkean herkkyytensä ja selektiivisyytensä vuoksi LC-MS-tekniikkaa on käytetty laajalti TCM-tutkimuksessa .
2. LC
Kromatografia erottaa seoksen käyttämällä kahden faasin (liikkuvan ja paikallaan pysyvän faasin) välisen jakaantumiskertoimen eroja. Liikkuvan faasin tilan mukaan kromatografia voidaan jakaa kaasukromatografiaan, nestekromatografiaan ja ylikriittisen nesteen kromatografiaan, kun taas pysyvän faasin geometristen muotojen mukaan kromatografia voidaan jakaa pylväskromatografiaan, paperikromatografiaan ja ohutkerroskromatografiaan. Yleisimmin käytetty LC-menetelmä on kolonnikromatografia, jossa liikkuvana faasina on neste. Korkean suorituskyvyn nestekromatografia (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) on modifioitu klassisen nestekolonnikromatografian pohjalta.
LK:n käyttö jaetaan kahteen luokkaan. Toinen niistä on laadullinen tai määrällinen tietyn koostumuksen osalta. Kvalitatiivisuus hallitaan näytteen ja kohdekomponentin välisen yhdenmukaisuuden mukaan piikkiaikana . Kvantitointi suoritetaan standardikäyrän mukaan, joka syntyy sen jälkeen, kun standardit on injektoitu eri pitoisuustasoilla. Toinen on sormenjälki, joka viittaa käsitykseen, että sen jälkeen, kun sormenjälkinäyte on hävitetty jollakin tavalla, voimme saada kromatogrammin tai spektrogrammin merkittyjen kemiallisten ominaisuuksien käyttämällä tiettyjä analyysimenetelmiä.
LC: llä on suuri etu kyvystä erottaa monimutkaisia näytteitä, joten se on tehokkain vaihtoehto, kun sitä sovelletaan seosten erottamiseen, mutta se ei sovellu materiaalin rakennetiedon saamiseen . Tuntemattomien yhdisteiden ja standardien piikkipaikkojen välisen kontrastin avulla valmistunut kvalitatiivisuus ei ole käytettävissä tuntemattomien yhdisteiden seurannassa.
3. MS
Massaspektrometriaa käytetään laajalti TCM-tutkimuksen alalla sen korkean selektiivisyyden, suuren herkkyyden ja kyvyn antaa tietoa, mukaan lukien suhteellinen molekyylimassa ja rakenteelliset ominaisuudet. MS täydentää kvalitointia molekyylimassan ja asiaankuuluvien rakenteellisten tietojen avulla ja täydentää kvantitointia piikin ja piikin edustaman yhdisteen sisällön suhteiden avulla. MS:n ilmakehän paineionisaatiossa (API) on sähkösumuionisaatio (ESI) ja kemiallinen ionisaatio ilmakehän paineessa (APCI) . Monille yhdistetyypeille ESI:llä on suuri herkkyys. ESI:hen verrattuna APCI soveltuu vähemmän polaarisille yhdisteille ja haihtuvien yhdisteiden analysointiin. Käytettyjen massa-analysaattoreiden eroista riippuen yleiset MS:t ovat kvadrupolimassaspektri (Q-MS), lentoaikamassaspektri (TOF-MS) ja ioniloukku-massaspektrometria (IT-MS) .
Tandem-massaspektrometrialla tarkoitetaan kahta tai useampaa yhdessä toimivaa MS:ää. Yleisimmin käytetty tandem-massaspektrometria on kolmoiskvadrupolimassaspektrometria (QQQ-MS). Jotta kvadrupolia voidaan käyttää monivaiheiseen massaspektrometriaan, kolme kvadrupolia sijoitetaan peräkkäin, mikä on kolmoiskvadrupoli . Toinen tandem-massaspektrometriatyyppi, kuten kvadrupoli-aikainen massaspektrometria (Q-TOF-MS) ja kvadrupoli-ioniloukku-tandem-massaspektrometria (Q-IT-MS), koostuu myös erilaisista laatuanalysaattorisarjoista . Ioniloukku-aikasarjalla voidaan saavuttaa monivaiheisia MS-skannauksia peräkkäin eri aikoina, joten tässä tutkimuksessa IT-MS luokiteltiin tandem-massaspektrometriksi.
Tandem-massaspektrometria voi indusoida ensimmäisen vaiheen MS: n tuottamien molekyyli-ionien fragmentteja, joiden mukaan voimme päätellä lapsen ja vanhemman välistä suhdetta, saada molekyylin rakennetietoja ja sitten ehdottaa yhdisteen rakennetta ja suorittaa tunnettujen ja tuntemattomien yhdisteiden laatuanalyysin tarkemmin.
Vaikka MS voi antaa materiaalin rakennetietoja, se vaatii näytteen suurempaa puhtautta. TCM-tutkimuksessa sitä käytetään yleensä yhdessä LC:n kanssa.
4. LC-MS
LC-MS-tekniikalla, jossa käytetään LC:tä erottelujärjestelmänä ja MS:ää havaitsemisjärjestelmänä, saavutetaan lopulta spektri. Kun LC ja MS työskentelevät yhdessä, ne voivat suorittaa monivaiheisen MS:n yhdisteen rakenteen spekuloimiseksi, mikä viimeistelee laadullisen ja määrällisen analyysin tarkemmin .
Haemme LC-MS: ää koskevat paperit TCM-tutkimuskirjallisuuden soveltamisessa, jotka on julkaistu viimeisten viiden vuoden aikana kotimaassa ja ulkomailla, havaitsimme, että ne voidaan jakaa kahteen luokkaan, eli LC-Q-MS ja LC-MS / MS. Kunkin menetelmän erojen sekä etujen ja haittojen analysoimiseksi paperit luokiteltiin tandem-massaspektrometrian eron mukaan.
4.1. LC-Q-MS
LC-Q-MS:ää voidaan käyttää standardikomponenttien kvalitatiiviseen ja kvantitatiiviseen analyysiin, kuten taulukossa 1 esitetään. Kvalitatiivista analyysia suoritettaessa voimme saada rakenteellista tietoa skannaamalla positiivisia tai negatiivisia ioneja . Voimme myös tehdä selväksi, millaiseen aineeseen kemiallinen rakenne kuuluu vertaamalla sitä standardikirjallisuuteen . LC-Q-MS kvantifioi yhdisteet valittujen spesifisten ionien perusteella seurantaa varten . Standardien puuttuessa LC-Q-MS voi suorittaa aineen laadullisen analyysin käyttämällä massaspektrometrian vahvoja laadullisia ominaisuuksia .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LC-Q-MS:llä voidaan analysoida aineita kvalitatiivisesti, mutta joitakin isomeerejä tai identtisen molekyylipainon omaavia aineita on tutkittava tarkemmin, ja niiden rakenteet on tunnistettava tarkemmin monivaiheisen massaspektrometrian avulla. Lisäksi epätarkka kvalitatiivinen määritys johtaa kvantitatiivisen määrityksen vääristymiseen.
4.2. LC-MS/MS
4.2.1. LC-IT-MS
IT-MS:llä otetaan talteen ionien eri laatualueet käyttämällä rengaselektrodeihin sovellettavia erikokoisia RF-jännitteitä. Sillä on suuri herkkyys, ja yhdellä IT-MS:llä voidaan saavuttaa monitasoiset massaspektrometriset toiminnot .
IT-MS voi toteuttaa aikasarjan monivaiheisia MS-skannauksia eri aikajärjestyksissä, mikä tarjoaa ainesosan MSn-fragmentaatiota; näin ollen se soveltuu laadulliseen aineeseen, joka tarjoaa rakenteellista tietoa tuntemattoman koostumuksen tunnistamiseksi, kuten taulukossa 2 on esitetty. TCM:n tutkimuksessa LC-IT-MS:ää käytetään yleisesti laadullisessa koostumuksessa .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4.2.2. LC-QQQ-MS
Triple quadrupole tarkoittaa, että kolme kvadrupolia on sijoitettu järjestyksessä. Jokaisella kvadrupolilla on erillinen tehtävä. Kolminkertaisen kvadrupolin skannaustiloja ovat täysi skannaustila, tuoteionien skannaustila, emäionien skannaustila, neutraalihäviöiden skannaustila, valittujen ionien skannaustila ja useiden reaktioiden monitoroinnin skannaustila .
LC-QQQ-MS:ää käytetään pääasiassa kvantifiointiin, kuten taulukossa 3 on esitetty. Joitakin tutkimuksia käytetään kvalitointiin . Verrattuna LC-Q-Q-MS:ään LC-QQQ-MS voi valita tietyt ionit törmäämään ja analysoida fragmentit törmäyksen jälkeen. LC-QQQ-MS voi havaita emoionin ja tytärionin samanaikaisesti, joten se on tarkka, herkkä ja kattava. LC-QQQ-MS:ää voidaan käyttää laajemmalla alueella. Verrattuna muihin tandem-massaspektrometrioihin kolmoiskvadrupoli on paras kvantitatiivinen toistettavuus. LC-QQQ-MS on yleisimmin tunnettu aineiden kvantitatiivinen menetelmä.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4.2.3. LC-Q-TOF-MS
LC-Q-TOF-MS:ää käytetään yleensä kvalitointiin. Sen havaitsemisherkkyys ja massan erottelukyky ovat korkeammat. LC-Q-TOF-MS voi mitata tarkasti massan .
LC-Q-TOF-MS:ää käytetään pääasiassa materiaalin laadulliseen analyysiin , kuten taulukossa 4 on esitetty. Verrattuna useisiin muihin tandem-massaspektrometrioihin sillä on etuja havaitsemisherkkyyden, massatarkkuuden ja resoluution suhteen. Korkea resoluutio ja massatarkkuus antavat LC-Q-TOF-MS:lle paremmat kvalitatiiviset valmiudet fragmentti-ionien suhteen. Se on myös vakuuttavampi, kun erotetaan ionien rakenne ja isomeerit tuntemattomien rakenteiden jäsentämisen lisäksi tässä menetelmässä .
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5. Johtopäätökset
Vertailtuna LC-MS- ja LC-MS/MS-menetelmiin LC-MS/MS-tutkimusta tehdään suhteellisesti enemmän, mikä on tunnettujen ja tuntemattomien yhdisteiden laadullisen analyysin suurempi tarkkuus. LC-IT-MS:llä on monitasoisen massaspektrometriakyvyn ansiosta parempi suorituskyky arvioitaessa tuntemattoman koostumuksen rakennetta. LC-Q-IT-MS:llä on parempi resoluution laatu kuin LC-IT-MS:llä. Kolmeen muuhun LC-MS/MS-menetelmään verrattuna LC-QQQ-MS:ää käytetään useammin tutkimuksessa, ja sen kvantitatiivinen kyky on muita parempi. Sen laadullinen kyky on hyvä, mutta ei vielä yhtä hyvä kuin LC-Q-TOF-MS. LC-Q-TOF-MS:ää käytetään pääasiassa aineen laadulliseen analyysiin. Jotkin sen kyvyt ovat suhteellisen erinomaisia, kuten havaitsemisherkkyys, massatarkkuus ja resoluutio.
Kvalitatiiviset menetelmät eroavat toisistaan eri LC-MS-menetelmissä, kun taas kvantitatiiviset menetelmät ovat periaatteessa samoja, koska kaikki kvantitatiiviset menetelmät edellyttävät standardia, jolla on erilaiset pitoisuudet. Kvantitatiiviset menetelmät jaetaan yleensä kahteen eri tyyppiin: ulkoisen standardin menetelmä ja sisäisen standardin menetelmä. Ulkoinen standardimenetelmä tarkoittaa, että kvantitatiivisen analyysin suorittamiseksi luodaan ensin standardikäyrä, jonka vaaka-akseli edustaa pitoisuuksia ja pystyakseli väripiikkispektrin aluetta. Sen jälkeen voidaan tehdä kvalitatiivinen analyysi piikin pinta-alan mukaan. Sisäisen standardin menetelmä tarkoittaa, että näytteen ja hybridivertailuaineen liuoksiin lisätään ensin sisäinen standardi, jonka konsentraatio tunnetaan; sen jälkeen muodostetaan standardikäyrä, jonka vaaka-akseli edustaa vertailunäytteen konsentraation suhdetta sisäisen standardin näytteen konsentraatioon ja pystyakseli edustaa standardipiikin pinta-alan suhdetta sisäisen standardin piikin pinta-alaan. Lopuksi sisäinen standardinäyte injektoidaan. Testi-indikaattoreiden ja sisäisen standardin piikkipinta-alan mukaan voidaan tehdä kvalitatiivinen analyysi.
TCM:n tutkimuksessa päädytään siihen, että LC-Q-TOF-MS on parempi valinta kvalitatiiviseen analyysiin, kun taas LC-Q-QQQ-MS osoittautuu paremmaksi kvantitatiiviseen analyysiin. Kvantitatiivinen analyysi suoritetaan käyttämällä spesifistä standardia, jolla on spesifinen pitoisuus. Laadullisella analyysillä voidaan mitata joidenkin tuntemattomien ainesosien rakennetta ja spekuloida niiden ominaisuuksia olemassa olevan tutkimuskirjallisuuden ja tietokannan antamien tietojen perusteella. Standardin validointi on tarkin laadullisessa aineistossa. TCM:n monimutkaisen koostumuksen ja tuntemattomien kykyjen vuoksi tutkimusmenetelmät eivät vielä pysty vastaamaan tarpeeseen. Lisätutkimus ja -etsintä ovat edelleen tarpeen.
Kilpailevat intressit
Kaikki kirjoittajat ilmoittavat, että heillä ei ole kilpailevia intressejä.
Kiitokset
Tämä työ on saanut tukea Kiinan kansallisesta luonnontieteellisestä säätiöstä (no. 81273925).