Abstract

Munanestettä (AF) ja lapsivesikalvoa (AM) on äskettäin luonnehdittu lupaaviksi kantasolujen tai esisolujen lähteiksi. Molemmat eivät ainoastaan sisällä osapopulaatioita, joilla on aikuisten kantasoluja muistuttavia kantasoluominaisuuksia, kuten mesenkymaalisia kantasoluja, vaan niillä on myös joitakin alkion kantasoluominaisuuksia, kuten (i) pluripotenssimarkkereiden ilmentyminen, (ii) suuri ekspansio in vitro tai (iii) monilinjainen erilaistumiskyky. Viime aikoina on keskitytty näiden kantasolutyyppien eristämiseen ja yksityiskohtaiseen karakterisointiin. Vaihtelut niiden fenotyypissä, eri ryhmien kuvaama heterogeenisuus ja yhden ainoan vain näissä soluissa ilmenevän merkkiaineen puuttuminen voivat kuitenkin estää puhtaan homogeenisen kantasolupopulaation eristämisen näistä lähteistä ja näiden solujen mahdollisen käytön terapeuttisissa sovelluksissa. Tässä artikkelissa pyrimme tekemään yhteenvedon viimeaikaisesta edistyksestä sikiölähteistä, kuten AF:stä ja AM:stä, peräisin olevien kantasolujen markkereiden löytämisessä käyttämällä transkriptomiikkaan, proteomiikkaan tai sekretomianalyyseihin perustuvia uusia menetelmiä.

1. Johdanto

Sekä lapsivesi (AF) että lapsivesikalvo (AM) ovat runsaita kantasolujen lähteitä, joita voidaan tulevaisuudessa käyttää kliinisiin terapeuttisiin sovelluksiin. Eettiset huolenaiheet, jotka liittyvät kantasolujen eristämiseen näistä lähteistä, ovat vähäisiä, toisin kuin ihmisen alkion kantasolututkimuksen (ESC) yhteydessä esiin tulleet kysymykset. AF kerätään 15.-19. raskausviikon välisenä aikana suunnitellun lapsivesitutkimuksen yhteydessä raskaudenaikaista diagnoosia varten, ja ylimääräistä näytettä voidaan käyttää solujen hankintaan, kun taas AM kerätään yleensä raskauden päättymisen jälkeen keisarileikkauksen yhteydessä. Koska näistä lähteistä peräisin olevat kantasolupopulaatiot ovat heterogeenisiä, tiettyjen solutyyppien eristäminen on vaikeaa ja edellyttää kyseisten solujen yksityiskohtaista fenotyyppistä ja molekulaarista karakterisointia. Tutkimukset, jotka sisältävät omics-lähestymistapoja, ovat perustavanlaatuisia, jotta voidaan ymmärtää paremmin näiden solujen molekyylien ilmentymismekanismeja ja määritellä oikeat menetelmät niiden eristämiseksi ennen niiden käyttöä terapeuttisissa lähestymistavoissa.

Tässä artikkelissa pyritään esittelemään AF:stä ja AM:stä peräisin olevien kantasolujen tärkeimmät biologiset ja molekulaariset ominaisuudet sekä tuomaan esiin viimeaikaiset edistysaskeleet merkkiaineiden löytämisessä käyttäen globaalimenetelmiä, kuten transkriptomiikka-, proteomiikka- tai sekretomianalyysejä.

1.1. Lapsivesi

AF toimii kehittyvän alkion suojaavana nesteenä, joka tarjoaa mekaanista tukea ja tarvittavia ravintoaineita alkionmuodostuksen aikana . Lapsivesipunktiota on käytetty vuosikymmenien ajan rutiinimenetelmänä sikiön karyotyypin määrityksessä ja synnytystä edeltävässä diagnostiikassa, ja sen avulla on voitu havaita monia geneettisiä sairauksia .

Kerrosnesteen pääkomponentti on vesi; sen kokonaiskoostumus kuitenkin vaihtelee raskauden aikana. Raskauden alussa lapsiveden osmolaarisuus on samanlainen kuin sikiön plasman. Sikiön ihon keratinisoitumisen jälkeen lapsiveden osmolariteetti laskee suhteessa äidin tai sikiön plasmaan, mikä johtuu pääasiassa sikiön virtsan sisäänvirtauksesta . Vielä mielenkiintoisempaa on, että AF on myös rikas lähde kantasolupopulaatiolle, joka on peräisin joko sikiöstä tai ympäröivästä lapsivesikalvosta . Useiden ryhmien lisätutkimukset ovat viime aikoina keskittyneet lapsivesistä peräisin olevien solujen soluominaisuuksiin ja niiden mahdolliseen käyttöön prekliinisissä malleissa ja elinsiirtohoidoissa .

1.1.1. Lapsivesikantasolut (Amniotic Fluid Stem Cells, AFSCs)

Munanesteen solut (Amniotic Fluid Cells, AFCs) edustavat heterogeenista populaatiota, joka on peräisin kolmesta sukukerroksesta. Näillä soluilla on yhteinen epiteeliperusta, ja ne ovat peräisin joko kehittyvästä alkiosta tai lapsivesikalvon sisäpinnalta, joita luonnehditaan lapsivesikalvon kantasoluiksi . AFC-solut koostuvat pääasiassa kolmesta tarttuvien solujen ryhmästä, jotka luokitellaan niiden morfologisten, kasvuun liittyvien ja biokemiallisten ominaisuuksien perusteella . Epiteelisolut (E-tyyppi) ovat kuutiomaisia tai pylväsmäisiä soluja, jotka ovat peräisin sikiön ihosta ja virtsasta, lapsivesisolut (AF-tyyppi) ovat peräisin sikiön kalvoista, ja fibroblastiset solut (F-tyyppi) syntyvät pääasiassa kuitumaisesta sidekudoksesta. Sekä AF- että F-tyypin soluilla on fibroblastoidinen morfologia, ja hallitseva solutyyppi näyttää olevan AF-tyyppi, joka ilmentää keratiinia ja vimentiiniä . Useat tutkimukset ovat osoittaneet, että ihmisen lapsiveden kantasoluja (AFSC) voidaan helposti saada pienestä määrästä toisen raskauskolmanneksen AF:ää, joka on kerätty rutiininomaisen lapsivesitutkimuksen yhteydessä, jolloin spontaanien raskaudenkeskeytysten osuus on 0,06-0,5 % . Tähän mennessä on raportoitu useita erilaisia viljelyprotokollia, jotka ovat johtaneet rikastettuihin kantasolupopulaatioihin. Klemmt et al. tekivät hiljattain yhteenvedon AFSC:n eristämisestä ja vastaavista viljelykäytännöistä, ja ne voidaan luokitella seuraavasti: (i) yksivaiheinen viljelyprotokolla, jossa primaariviljelmän annettiin olla rauhassa vähintään 7 päivän ajan, kunnes ensimmäiset pesäkkeet ilmestyivät , ii) kaksivaiheinen viljelyprotokolla, jossa amnioyytit, jotka eivät olleet kiinnittyneet 5 päivän jälkeen kulttuurissa, kerättiin talteen ja laajennettiin edelleen , iii) solujen pintamarkkereiden valinta CD117:n (c-kit-reseptori) varalta , iv) mekaaninen eristäminen alkuviljelmissä muodostuneista alkuvaiheen mesenkymaalisista kantasolukoloniatyypeistä ja v) lyhytaikaiset viljelmät, joilla pyrittiin saamaan aikaan fibroblastoidipesäkkeitä . Suurin osa näillä menetelmillä eristetyistä AFSC-soluista oli multipotenttia mesenkymaalista fenotyyppiä ja niillä oli suurempi proliferaatiopotentiaali ja laajempi erilaistumispotentiaali verrattuna aikuisten MSC-soluihin.

1.2. Lapsivesikalvo (AM)

Lapsivesikalvo, josta puuttuu verisuonikudos, muodostaa suurimman osan sikiökalvon sisimmästä kerroksesta, ja se koostuu kolmesta kerroksesta: (i) epiteelisoluista koostuvasta epiteelimonokerroksesta, (ii) akellulaarisesta välikerroksesta ja (iii) ulommasta mesenkyymisolukerroksesta, jossa on runsaasti mesenkymaalisia kantasoluja ja joka sijoittuu chorionin läheisyyteen . AM:ää on käytetty kliinisesti vuosikymmeniä palovammojen haavan paranemiseen, epiteelin muodostumisen edistämiseen ja infektioilta suojaamiseen . Viime aikoina AM:n käyttöä on arvioitu haavasidosmateriaalina suun limakalvon kirurgisissa defekteissä, silmänpinnan rekonstruktiossa, sarveiskalvon rei’ityksissä ja virtsarakon laajentamisessa.

1.2.1. Lapsivesikalvon kantasolut (AMSC:t)

Amnioottikalvon kantasoluihin (AMSC:t) kuuluu kahta tyyppiä, lapsivesikalvon epiteelisoluja (AEC:t) ja lapsivesikalvon mesenkymaalisia kantasoluja (AM-MSC:t), jotka ovat peräisin lapsivesikalvon epiteelikerroksesta ja lapsivesikalvon mesenkymaalikerroksesta . Molemmat solutyypit syntyvät kehittyvän alkion pregastrulaatiovaiheessa ennen kolmen primaarisen sukukerroksen rajautumista, ja ne ovat luonteeltaan enimmäkseen epiteelisoluja . AEC- ja AM-MSC-solujen eristämiseen on laadittu erilaisia protokollia, jotka perustuvat pääasiassa AM:n mekaaniseen erottamiseen korionikalvosta ja sitä seuraavaan entsymaattiseen pilkkomiseen . AM-MSC:t osoittivat plastista tarttuvuutta ja fibroblastoidista morfologiaa, kun taas AEC:t osoittivat mukulakiviepiteelin fenotyyppiä. AM-MSC:llä oli samanlaiset fenotyyppiset ominaisuudet kuin aikuislähteistä peräisin olevilla soluilla. Vielä mielenkiintoisempaa on, että AM-MSC:llä oli AF-MSC:n tavoin korkeampi proliferaatiovauhti verrattuna aikuislähteistä peräisin oleviin MSC:iin ja monilinjainen erilaistumispotentiaali kolmesta sukukerroksesta peräisin oleviksi soluiksi.

2. Immunofenotyyppi

2.1. AEC:n erilaistuminen. Lapsiveden kantasolut

Lapsivesi on viime aikoina noussut vaihtoehtoiseksi sikiöaikaiseksi lähteeksi erilaisille kantasoluperäisille soluille . Tässä pyrimme tiivistämään keskeiset merkkiaineet, jotka luonnehtivat AFSC-soluja. Tähän mennessä MSC-solut edustavat parhaiten karakterisoitua AFSC-solujen osapopulaatiota. AF-MSC:t osoittivat tyypillistä mesenkeemisten merkkiaineiden ilmentymistä, kuten CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58 ja CD44, jotka määritettiin virtaussytometria-analyyseillä . Lisäksi nämä solut ilmaisivat HLA-ABC-antigeenejä, kun taas hematopoieettisten merkkiaineiden CD34 ja CD45, endoteelin merkkiaineen CD31 ja HLA-DR-antigeenin ilmentymistä ei havaittu . Vielä tärkeämpää on, että suurin osa viljellyistä AF-MSC:istä ilmaisi pluripotenssimarkkereita, kuten oktameeria sitovaa proteiinia 3/4 (Oct-3/4), homebox-transkriptiotekijä Nanogia (Nanog) ja vaihespesifistä embryonista antigeenia 4 (SSEA-4) .

Se raportoitiin myös, että amnosoluviljelmät sisälsivät pienen populaation CD117-positiivisia soluja (kantasolutekijälle spesifinen tyrosiinikinaasitekijä, joka esiintyy ensisijaisesti ESC-yksilöissä ja alkukantaisissa sukusoluissa), jotka voivat laajentua klooninomaisesti viljelmässä . CD117+ AFS:n erilaistumisominaisuudet testattiin ensimmäistä kertaa in vivo, mikä osoitti niiden kantasoluidentiteetin . Kokeelliset todisteet viittasivat siihen, että AFSC:t ovat peräisin karanmuotoisista fibroblastoidisoluista .

Yrittiessämme analysoida AFSC:iden osapopulaatioita ryhmämme tunnisti hiljattain kaksi morfologisesti erilaista mesenkimaalista alkuperää olevien AFSC:iden populaatiota, joilla on erilaiset proliferaatio- ja erilaistumisominaisuudet, ja niitä kutsuttiin nimityksillä karanmuotoiset (spindle shaped, SS) ja pyöreät (round shaped, RS) . Molemmat osapopulaatiot ilmentävät mesenkeemisten kantasolujen merkkiaineita samankaltaisella tasolla. Kuitenkin havaittiin, että SS-pesäkkeet ilmaisivat enemmän CD90- ja CD44-antigeenejä kuin RS-pesäkkeet .

2.2. Lapsivesikalvon kantasolut (AMSC:t)

AMSC:iden yksityiskohtainen immunofenotyyppianalyysi paljasti antigeenien, kuten CD13, CD29, CD44, CD49e, CD54, CD73, CD90, CD105, , CD166, , stroomaalinen kantasolumarkkeri 1 (Stro-1), SSEA-3, SSEA-4, kollageenit I ja III (Col1/Col3), alfa-sileä lihasaktiini (α-SMA), CD44, vimentiini (Vim), fibroblastien pintaproteiini (FSP) ja HLA-ABC-antigeeni . Solujen välistä adheesiomolekyyliä 1 (ICAM-1) ilmentyi kuitenkin hyvin vähän, eikä TRA-1-60-proteiineja, verisuonisolujen adheesioproteiinia 1 (VCAM-1), von Willebrandin tekijää (von Willebrand factor, vWF), verihiutaleiden endoteelisolujen adheesiomolekyyliä (PECAM-1), CD3:aa ja HLA-DR:ää havaittu . Yksi AM-peräisten solujen runsaimmista proteiineista on laminiini, jolla on keskeinen rooli erilaistumisessa, solujen muodossa ja siirtymisessä sekä kudosten uudistumisessa . RT-PCR-analyysi osoitti lisäksi, että AMSC-solut ilmentävät geenejä, kuten Oct-3/4, sinkkisormiproteiini 42 (zfp42 tai Rex-1), kantasolutekijäproteiini (SCF), hermosolujen adheesiomolekyyli (NCAM), nestiini (NES), luun morfogeneettinen proteiini 4 (BMP-4), GATA-sitoutuva proteiini 4 (GATA-4) ja hepatosyyttien ydintekijä 4α (HNF-4α), jopa korkeissa läpikäynneissä. Brachyury, fibroblastikasvutekijä 5 (FGF5), paritettu laatikkoproteiini (Pax-6) ja luun morfogeneettisen proteiinin 2 (BMP2) transkriptioita ei havaittu . Samoin AEC:t olivat positiivisia CD10-, CD13-, CD29-, CD44-, CD49e-, CD73-, CD90-, CD105-, CD117-, CD166-, Stro-1-, HLA-ABC- ja ja negatiivisia CD14-, CD34-, CD45-, CD49d- ja HLA-DR-ekspressioiden suhteen FACS-analyysien perusteella . Lisätutkimukset osoittivat, että AEC:t ilmentävät kantasolujen merkkiaineita, kuten SSEA-1:tä, SSEA-3:a, SSEA-4:ää, Nanogia, sukupuolta määrittävää Y-box 2:ta (Sox2), Tra1-60:a ja Tra1-80:a, fibroblastikasvutekijä 4:ää (FGF4), Rex-1:tä, kryptistä proteiinia (CFC-1) ja prominiini 1:tä (PROM-1) .

3. Transkriptomiikka

3.1 . Lapsivesikantasolut

Tsai ym. tekivät alun perin toiminnallisen analyysin AF-MSC:iden geeniekspressiosignatuurista verrattuna luuydin- (BM-), sydänveri- (CB-) ja AM-MSC:iin. Kaikista kolmesta lähteestä peräisin olevissa MSC:ssä ilmentyvät geenit voitiin luokitella ryhmiin, jotka liittyvät i) solunulkoisen matriisin uudelleenmuodostukseen (CD44, kollageeni II (COL2), insuliinin kaltainen kasvutekijä 2 (IGF2), ja metalloproteinaasi 1:n kudosinhibiittori (TIMP1)), (ii) sytoskeletin säätelyyn (urokinaasityyppinen plasminogeeniaktivaattori (PLAU) ja reseptori (PLAUR)), (iii) kemokiinien säätelyyn ja adheesioon (alfa-aktiniini 1 (ACTN1), aktiiniin liittyvä proteiinikompleksin alayksikkö 1B (ARPC1B) ja trombospondiini 1 (THBS1)), iv) plasmiinin aktivointi (tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2)), (v) transformoivan kasvutekijä β:n (TGFβ) reseptorisignalointi (kaveoliini 1 (Cav1), kaveoliini 2 (Cav2), sykliini-riippuvainen kinaasi-inhibiittori 1A (CDKN1A)) ja vi) E3-ubikitiiniligaaseja koodaavat geenit (SMURF) . AF-MSC-geeneissä BM-, CB- ja AM-MSC-geeneihin verrattuna ylössäätyneisiin geeneihin kuuluivat kohdun kypsymiseen ja supistumiseen osallistuvat molekyylit, kuten oksitosiinireseptori (OXTR) ja prostaglandiinisynteesin säätely, kuten fosfolipaasi A2 (PLA2G10).

Viimeaikaisissa AFSC:tä koskevissa tutkimuksissa Kim et al. kuvasivat ensimmäistä kertaa geeniekspression muutoksia AFSC:n kokonaispopulaatiossa eri läpikäyntien aikana Illumina-mikrosarja-analyysin avulla. Havaittiin 1970 differentiaalisesti ilmentynyttä geeniä, jotka luokiteltiin niiden ilmentymisprofiilien mukaan 9 erilliseen klusteriin . Geenejä, joiden ilmentymistasot kasvoivat asteittain, olivat muun muassa kemokiini (C-X-C-motiivi) ligand 12 (CXCL12), kadheriini 6 (CDH6) ja folaattireseptori 3 (FOLR3). Alasreguloituneita geenejä olivat muun muassa sykliini D2 (CCND2), keratiini 8 (K8), IGF2, natriureettisen peptidin esiaste (BNP) B ja solun retinohappoa sitova proteiini 2 (CRABPII) . Lisätietojen saamiseksi suoritettiin ikääntymisen geenejä koskeva sirutietoanalyysi, joka paljasti geenien, kuten hermokasvutekijä beetan (NGFβ), insuliinireseptorin substraatin 2 (IRS-2), insuliinin kaltaisen kasvutekijän sitovan proteiinin 3 (IGFBP-3) ja apolipoproteiini E:n (APOE:n), transkriptioiden kohoamisen. Geenien, kuten PLAU:n, E2F-transkriptiotekijä 1:n (E2F1), IGF2:n, rintasyövän tyypin 1 alttiusgeenin (BRCA1), DNA-topoisomeraasi 2-alfa:n (TOP2A), proliferoivan solun ydinantigeenin (PCNA) ilmentyminen, forkhead box M1 (FOXM1), sykliini-A2-geeni (CCNA2), budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta (BUB1B) ja sykliini-riippuvainen kinaasi 1 (CDC2), vähitellen alaspäin viljelyn aikana .

Wolfrum ym. tekivät globaalin geeniekspressioanalyysin AFSC:istä verrattuna AF:stä johdettuihin iPSC:iin (AFiPSC) ja ESC:iin . Näistä geenit, jotka liittyvät itsensä uusiutumiseen ja pluripotenssiin (1299 geeniä, esim. POU-luokan 5 homeobox 1 (POU5F1), Sox2, Nanog, mikroRNA:ta sitova proteiini LIN28) ja AFSC:n spesifisyyteen (665 geeniä, esim, OXTR, HHAT, RGS5, neurofibromatoosi tyyppi 2 (NF2), protectiini (CD59), tuumorinekroositekijän superperheen jäsen 10 (TNFSF10), 5′-nukleotidaasi (NT5E)) havaittiin AFSC:ssä . Lisäksi kirjoittajat tutkivat senesenssiin ja telomeereihin liittyvien geenien ilmentymistä varhaisessa ja myöhemmässä vaiheessa olevissa AFSC-yksilöissä tutkiakseen uudelleenohjelmoinnin vaikutusta AFSC-viljelmissä havaitun senesenssin ohittamiseen. AFSC- ja AFiPSC-linjoihin verrattuna AFSC- ja AFiPSC-linjoissa ilmentyi eri tavoin 64 geeniä. Näistä telomeereihin liittyvät geenit ja solusyklin säätelyyn osallistuvat geenit, kuten mitotic arrest deficient-like 2 (MAD2L2), poly ADP-riboosipolymeraasi 1 (PARP1), replikaatioproteiini A3 (RPA3), dyskeratosis congenita 1 (DKC1), mutS homolog 6 (MSH6), CHK1 checkpoint homolog (CHEK1), polo-like kinase 1 (PLK1), POU-luokan 2 homeobox 1 (POU2F1), CDC2, Bloomin oireyhtymän geenin RecQ helikaasin kaltainen (BLM), Wernerin oireyhtymän RecQ helikaasin kaltainen (WRN), DNA:n metyylitransferaasi 1 (DNMT1), DNA:n metyylitransferaasi 3 beeta (DNMT3B), lamiini B1 (LMNB1) ja DNA:n replikointitekijä 1 (CDT1) olivat AFSC-yksilöissä alempana AFiPSC-yksilöissä AFiPSC-yksilöihin ja ESC:iin verrattuna. Sen sijaan peptidyyliprolyyli cis/trans-isomeraasi (PIN1), lamiini A/C (LMNA), kasvupysähdyksen ja DNA-vaurion indusoima alfa (GADD45A), kromoboksihomologi 6 (CBX6), NADPH-oksidaasi 4 (NOX4), endogliini (ENG), histoni H2B tyyppi 2-E (HIST2H2BE), CDKN1A, CDKN2A, kasvun erilaistumistekijä 15 (GDF15) ja seriiniproteaasi-inhibiittori 1 (SERPINE1) olivat muun muassa AFSC-yksilöissä AFiPSC- ja ESC-yksilöihin verrattuna.

3.2. Amniotic Membrane Stem Cells

Transkriptominen analyysi DNA-mikrosarjojen avulla on raportoitu AM-MSC:ille . Näistä kokeellisista tiedoista saatiin tietoa AM-MSC:n geeniekspressiomallista verrattuna AF-, CB- ja BM-MSC:iden geeniekspressioprofiileihin. AM-MSC:ssä tunnistettiin useita ylösreguloituneita geenejä, jotka osallistuvat immuunisopeutumisen säätelyyn äidin ja sikiön rajapinnan välillä. Muun muassa spondiini 2 (SPON2), interferoni, alfa-indusoituva proteiini 27 (IFI27), bradykiniinireseptori B1 (BDKRB1), pienet indusoituvat sytokiinien B-alatyypin jäsenet 5 ja 6 (SCYB5, SCYB6) ja Yamaguchin sarkooma-virukseen liittyvä onkogeenin homologi (LYN) havaittiin säännellyiksi . Lisäksi muita geenejä, joiden ilmentyminen oli lisääntynyt AM-MSC:ssä verrattuna AF-, CB- ja BM-MSC:hen, olivat i) transkriptiotekijät, kuten haarukkapään laatikko F1 (FOXF1), sydämen ja hermoruston johdannaisten ilmentymä 2 (HAND2) ja transkriptiotekijä 21 (TCF21), ja ii) metaboliset entsyymit, kuten dipeptidyylipeptidaasi 6 (DPP6), tryptofaanin 2,3-dioksygenaasi (TDO2) ja sialyyttitransferaasit (ST) .

4. Proteomitutkimus

4.1. Lapsivesikantasolut

Proteomitutkimukset koko AFSC-populaatiosta, mukaan lukien epitelioidiset (E-tyyppi), lapsivesispesifiset (AF-tyyppi) ja fibroblastiset (F-tyyppi) solut, paljastivat 2400 spottia, jotka johtivat 432 eri geenituotteen tunnistamiseen. Suurin osa proteiineista oli lokalisoitunut sytoplasmaan (33 %), mitokondrioihin (16 %) ja tumaan (15 %), ja ne edustivat pääasiassa entsyymejä (174 proteiinia) ja rakenneproteiineja (75 proteiinia). Myös kalvojen ja kalvoihin liittyvien proteiinien osuus oli suhteellisen suuri (7 %). Havaituista proteiineista 9 vastasi epiteelisolujen proteiineja, kuten ATP-syntaasin D-ketju (ATP5H), NADH-ubikinonioksidoreduktaasin 30 kDa:n alayksikkö (NUIM), annexiini II (Anx2), annexiini IV (Anx4), 40S-ribosomaalinen proteiini SA (Rpsa), glutationi-S-transferaasi P (GSTP), suuri holviproteiini ja sytokeratiinit 19 ja 7 (CK-19, CK-7), kun taas fibroblasteissa ilmoitettiin ilmentyvän 12 proteiinia, mukaan lukien fibronektiinit, tropomyosiinit, transgeliini (TAGLN), arp2/3-kompleksin 34 kDa:n alayksikkö (P34-arp), gelsoliini (Gsn), elongaatiotekijä 1-β (EF-1β) ja muut. Kahdeksan proteiinia havaittiin ilmentyvän keratinosyyteissä, mukaan lukien keratiinit, ribonukleoproteiinit, Anx2, aetyyli-CoA-asetyylitransferaasi (ACAT1) ja muut, kolme ilmentyvän epidermiksessä, mukaan lukien tropomyosiinit ja keratiinit, ja yksi mesenkyymisolutyypissä (vimentiini 1 (Vim 1)) .

Viimeaikaiset tutkimukset antoivat näyttöä siitä, että amnionin solujen metabolisten entsyymien ilmentymisen moninaisuus liittyy metabolisiin ja geneettisiin oireyhtymiin, ja näin ollen niiden havaitseminen saattaa olla tärkeää prenataalidiagnostiikassa. Oh et al. raportoivat yksityiskohtaisemman analyysin AFSC-soluissa esiintyvien spesifisten metabolisten entsyymien määrittämiseksi. Yhdeksänkymmentäyhdeksän proteiinia oli tunnistettu, kuten hiilihydraatteja käsitteleviä entsyymejä, aminohappoja käsitteleviä entsyymejä, puriinimetabolian proteiineja ja välittäjäaineenvaihdunnan entsyymejä .

Proteomianalyysi suoritettiin myös CD117+ AFSC:iden eri viljelyvaiheille, ja siinä havaittiin proteiinien ilmentymisen vaihteluita, joita esiintyi pääasiassa varhaisissa vaiheissa . Kaksikymmentäkolme proteiinia ilmentyi eri tavoin varhaisten ja myöhäisten läpikäyntien välillä, ja tarttuvimmat alasreguloituneet proteiinit olivat Col1, Col2, vinculin (Vcl), CRABP II, stathmin (STMN1) ja cofilin-1 (CFL1). Sitä vastoin TAGLN ja Col3 lisääntyvät passioiden aikana . Proteiinit, joiden pitoisuudet olivat epäsäännöllisiä passageiden aikana, olivat 26S-proteaasin säätelyalayksikkö 7 (PSMD7), ubikitiinikarboksyyliterminaalihydrolaasin isoentsyymi L1 (UCH-L1), heterogeeninen nukleaarinen ribonukleaarinen proteiini H (hnRNP H) ja TAR-DNA:ta sitova proteiini 43 (TDP-43) .

Vuonna 2007 rakennettiin ihmisen AF-MSC:n proteomikartta ja sitä verrattiin suoraan BM-MSC:stä saatuun karttaan . AF-MSC:stä tunnistettiin 261 erilaista proteiinia, joista suurin osa oli lokalisoitunut sytoplasmaan (41 %), kun taas muita proteiineja oli endoplasmisessa retikulumissa (8 %), ytimessä (13 %), mitokondrioissa (12 %), ribosomeissa (1 %), sytoskeletissä (6 %), sytoplasmassa ja ytimessä (5 %) sekä erittyviä proteiineja (2 %) . AF-MSC:t ekspressoivat useita proliferaatioon ja solujen ylläpitoon liittyviä proteiineja, kuten ubikviini-1:tä (UBQLN1), jonka tiedetään säätelevän solusyklin etenemistä ja solujen kasvua, proliferaatioon liittyvää proteiinia 2G4 (PA2G4), joka on nukleaarinen kasvua säätelevä proteiini, SPARC (secreted protein acidic and rich in cysteine), jota säädellään alkionkehityksen aikana ja joka osallistuu solusyklin ja soluadheesion hallintaan, ja ERH (enhancer of rudimentary homolog), joka myös säätelee solusykliä . TAGLN ja galektiini 1 (Gal 1), joita molempia esiintyy kantasoluissa ja jotka liittyvät erilaistumiseen, ilmentyivät myös runsaasti AF-MSC:ssä. Muut AF-MSC-soluissa runsaasti ilmentyneet proteiinit liittyivät i) kehitykseen, kuten Deltex-3:n kaltainen (DTX3L), ja ii) sytoskeletin organisointiin ja liikkeisiin, kuten CFL1, koaktosiinin kaltainen proteiini (CLP) ja enabled protein homolog (Enah). Odotetusti myös Vim ilmentyi suuria määriä AF-MSC:ssä. Tässä tutkimuksessa kuvattiin myös yksityiskohtainen vertailu AF-solujen ja AF-MSC-solujen yhteisistä tunnistetuista proteiineista .

Myöhemmässä tutkimuksessamme , laadimme 2-DE:llä proteomikartan kahdesta morfologisesti erilaisesta AF:n mesenkymaalisesta esiasteen solutyypistä (SS ja RS). Kahdessakymmenessäviidessä proteiinissa oli erilainen ilmentymä näissä kahdessa osapopulaatiossa. SS-AF-MSC-soluissa RS-AF-MSC-soluihin verrattuna ylösreguloituneisiin proteiineihin kuuluivat retikulokalbiini-3:n esiaste (RCN3), kollageeni α1 (I) (COL1α1), FK506:aa sitova proteiini 9:n esiaste (FKBP9), Rho-gpd-dissosiaatioinhibiittori 1 (RhoGDI), kloridien solunsisäinen kanavaproteiini 4 (CLIC4), tryptofanyyli-trna-syntetaasi (TrpRS), ja lämpösokkiproteiini (HSP70). Peroksiredoksiini 2 (Prdx2), 60 kD:n lämpösokkiproteiini (HSP60), GSTP ja Anx4 olivat säänneltyjä RS-AFMPC:ssä. RS-AF-MSC:ssä tunnistettuihin proteiineihin kuuluivat kuitenkin vain sytokeratiini-8, -18 ja -19 (CK-8, -18 ja CK-19), katekpsiini B (CTSB), CLP ja integriini αV-proteiini (CD51). Mesenkyymiin liittyvät proteiinit, kuten Vim, Gal, Gsn ja prohibitiini (PHB), ilmentyivät samalla tasolla molemmissa populaatioissa .

4.2. Lapsivesikalvon kantasolut

Hopkinson ym. kuvasivat yksityiskohtaisen lähestymistavan ihmisen AM-proteiinien tutkimiseen. Tässä tutkimuksessa kirjoittajat tekivät proteomianalyysin AM-näytteistä, jotka oli valmistettu ihmisen elinsiirtoa varten, käyttäen 2-DE-geelejä. Myös AM-näytteiden pesuaineita tutkittiin ja erittyvät proteiinit tunnistettiin. Sekä AM-näytteissä että pesuaineissa havaitut proteiinit viittasivat siihen, että proteiineja oli vapautunut osittain. Nämä proteiinit olivat enimmäkseen liukoisia sytoplasmaproteiineja, ja ne luokiteltiin niiden subcellulaarisen lokalisaation ja toiminnan mukaan. Yksi esimerkki AM:n runsaimmista ja johdonmukaisimmista proteiineista on THBS1, jolla on raportoitu olevan rooli haavan korjauksessa, tulehdusreaktiossa ja angiogeneesissä . Mimecan (myös osteoglysiini/OGN) on toinen AM:ssa havaittu proteiini, joka edustaa pientä leusiinirikasta proteoglykaania, jota esiintyy sidekudoksen ECM:ssä. Mimecanin on raportoitu ylläpitävän kudoksen vetolujuutta ja kosteutta. Lisäksi mimecanin suurempi muoto ilmentyi AM-soluissa ja oli altis proteolyyttiselle pilkkoutumiselle . TGF-β-indusoitua proteiinia ig-h3 (βIG-H3), ECM:n adheesiomolekyyliä, joka toimii kalvoon assosioituneena kasvutekijänä solujen erilaistumisen ja haavan paranemisen aikana, ja intergriini α6 (CD49f), joka on α6β4-integriinin komponentti, esiintyi myös merkittäviä määriä AM-soluissa . Tiedetään hyvin, että α6β4-βIG-H3-vuorovaikutuksella on tärkeä rooli solujen adheesion ja haavanparannussignaalireittien välittämisessä .

Toinen Baharvandin ym. tekemä tärkeä tutkimus keskittyi epiteelistä poistetun ihmisen AM:n analyysiin, joka osoitti sekä kvantitatiivisia että kvalitatiivisia eroavaisuuksia käsittelemättömään AM:ään verrattuna . He tutkivat ihmisen AM-epiteelin proteomia, jota käytettiin limbaalisena kantasolunichenä silmänpinnan rekonstruktion hoidossa . Kaikissa 2-DE-geeleissä havaittiin 515 pistettä, ja 43 proteiinia tunnistettiin MALDI TOF/TOF MS -menetelmällä AM:stä. Runsaimmin esiintyvät proteiinit olivat lumikaanin (LUM) ja OGN:n eri isomuodot, jotka molemmat kuuluvat proteoglykaaniperheeseen (PG). Erityisesti OGN:llä saattaa olla merkitystä monissa biologisissa prosesseissa, kuten solujen kasvussa, angiogeneesissä ja tulehduksessa . Muita havaittuja proteiineja olivat kollageeni VI α-1/α-2 (Col6a1/Col6a2), fibrinogeenin beetaketju (FGB), transglutaminaasi 2:n isomuoto A (TGM2A), b-aktiinivariantti (ACTB), 70 kD:n lämpösokkiproteiini 5 (HSPA5), nidogeeni 2 (NID2), CD49f, βIG-H3 ja tubulusinterstitiaalinen nefriittinestefriitti (TIN) . Jotkin tässä tutkimuksessa tunnistetuista proteiineista liittyivät myös solunulkoiseen matriisiin (ECM). Havaituista proteiineista fibronektiinin (FN), lamiinien sekä kollageenien IV (Col4) ja VII raportoitiin edistävän epiteelin adheesiota ja migraatiota .

5. Sekretomi

Viime aikoina on tapahtunut merkittävää edistystä AFSC:stä erittyvien proteiinien analysoinnissa. On dokumentoitu, että AFSC:n sekretomi oli vastuussa vaskuliogeneesin tehostamisesta ja kykeni herättämään voimakkaan angiogeenisen vasteen hiiren vastaanottajissa . Tämän tutkimuksen mukaan AFSC-konditionoidun väliaineen yksityiskohtainen analyysi paljasti tunnettujen proangiogeenisten ja antiangiogeenisten tekijöiden läsnäolon Luminexin MAP-teknologian avulla. Erittyviksi proteiineiksi tunnistettiin verisuonten endoteelin kasvutekijä (VEGF), stroomaalisista soluista peräisin oleva tekijä 1 (SDF-1), interleukiini 8 (IL-8), monosyyttien kemotaktinen proteiini 1 (MCP-1) ja kaksi angiogeneesin estäjää, interferonigamma (IFNγ) ja interferonigammasta indusoitunut proteiini 10 (IP-10) . Lisäksi osoitettiin, että suhteellisen pieni määrä AFSC:tä riittää erittämään havaittavan määrän proangiogeenisiä kasvutekijöitä ja sytokiineja. Näiden eritystä voidaan säädellä annosriippuvaisesti käytettyjen solujen alkuperäisen solumäärän mukaan .

AFSC:stä erittyviä proteiineja koskeva systemaattinen tutkimus johti siihen johtopäätökseen, että AFSC:stä peräisin olevat proangiogeeniset liukoiset tekijät voivat välittää endoteelin esiasteiden rekrytointia iskeemisessä rotan mallissa . Erityisesti AFSC:stä peräisin oleva ehdollistettu väliaine saattoi toimittaa paikallisesti angiogeenisia kasvutekijöitä ja sytokiineja iskeemisen rotan mallin iholäppään, ja se oli vastuussa endogeenisen korjauksen käynnistämisestä rekrytoimalla endoteelin progenitorisoluja.

Uudemmissa tutkimuksissamme tarkastelimme AF-MSC:iden ja niiden erittämien molekyylien terapeuttista potentiaalia akuuttia maksan vajaatoimintaa sairastavilla hiirillä . AF-MSC-konditionoidussa väliaineessa havaittiin erilaisia sytokiineja ja kasvutekijöitä. Havaittiin sytokiineja, kuten interleukiini 10 (IL-10), interleukiini 27 (IL-27), interleukiini 17 -perheen (IL-17E), interleukiini 12p70 (IL-12p70), interleukiini-1-beeta (IL-1β) ja interleukiini-1-reseptorin antagonisti (IL-1ra), jotka ovat vastuussa tulehdusta aiheuttavien välittäjäaineiden paikallisesta ja systeemisestä alenemisesta. Lisäksi erittyi SERPINE1:tä, MCP-1:tä ja SDF-1:tä, jotka edistävät kudosten korjaantumista. Kiinnostavaa oli, että voimakkaasti ilmentyneiden kasvutekijöiden joukossa olivat verihiutaleista peräisin oleva endoteelisolujen kasvutekijä (PD-ECGF), endostatiini/kollageeni XVII (EN/Col17), virtsan plasminogeeniaktivaattori (uPA), TIMP1, TIMP2, hepariiniin sitoutuva EGF:n kaltainen kasvutekijä (HB-EGF), fibroblastien 7-kasvutekijä (FGF7) ja epidermaali-kasvutekijä (EGF), jotka vastaavat maksan regeneraatiosta ja kudosten korjautumisesta .

6. Yhteenveto

Tämänhetkiset tiedot viittaavat siihen, että lapsivesi ja lapsivesikalvo voivat olla lupaavia lähteitä mesenkymaalista alkuperää oleville kantasoluille. MSC-soluja on todellakin runsaammin, ja niiden eristämiseen on kuvattu monenlaisia protokollia. On kuitenkin raportoitu, että samantyyppisten solujen erilaiset viljelyolosuhteet voivat vaikuttaa niiden erilaisiin geeniekspressiomalleihin, mikä rajoittaa niiden eristämistä ja laajentamista in vitro. Näiden solujen proteiiniprofiilin määrittämiseen tähtäävät tutkimukset, mukaan lukien fenotyyppinen analyysi, jossa käytetään menetelmiä, kuten virtaussytometriaa ja immunohistokemiaa, sekä transkriptomiikka-, proteomiikka- ja sekretomianalyysimenetelmiä (kuva 1). Tällaisten tutkimusten tuottamien tietojen odotetaan selventävän niiden erilaista repertuaaria ja validoivan näiden kantasolujen molekyyliprofiilin. Tärkeimpänä kysymyksenä on kuitenkin sellaisen homogeenisen populaation eristäminen, joka voi helpottaa järjestelmällisiä tutkimuksia näiden monipotenttien solujen toiminnan selvittämiseksi.

Kuva 1

Yhteenveto tärkeimmistä markkereista, jotka on tunnistettu AFC- ja AMC-soluissa transkriptomiikka-, proteomiikka-, sekretomiikka- ja immunofenotyyppianalyysien avulla. Useammassa kuin yhdessä tutkimuksessa tunnistetut proteiinit on merkitty lihavoituna.

Tällaiset lähestymistavat voivat johtaa sellaisten keskeisten antigeenien tunnistamiseen, jotka heijastavat näiden solujen fenotyyppiä ja selittävät niiden erityispiirteitä ominaisuuksia. Tämäntyyppiset tutkimukset avaavat tien näiden solujen systemaattiselle ja tehokkaalle eristämiselle ennen niiden käyttöä kliinisessä ympäristössä.

Liite

Jatkotutkimuskysymykset

Mitkä ovat sopivat AFSC- tai AMSC-solujen eristysmenetelmät ja viljelyolosuhteet, jotka mahdollistavat johdonmukaisen fenotyypin tunnistamisen?

Onko olemassa yhtä ainoaa merkkiainetta, jota voidaan käyttää AFSC- tai AMSC-populaatioiden eristämiseen?

AFSC- ja AMSC-populaatiot ovat heterogeenisiä ja eroavat toisistaan fenotyyppisiltä ja molekyyliominaisuuksiltaan. Eristysmenetelmillä voidaan saada aikaan homogeeninen solupopulaatio.

AFSC- tai AMSC-populaatioita voidaan käyttää apuvälineinä regeneratiivisessa lääketieteessä: sellaisten viljelyolosuhteiden luominen, joissa käytetään mahdollisimman vähän tai ei lainkaan eläinperäisiä aineita.

Markkereiden löytäminen
AfSC- ja AMSC-populaatioiden alustava karakterisointi voidaan suorittaa immunofenotyyppianalyysillä käyttämällä hyvin karakterisoituja solupintamerkkiaineita, kuten AFSC:t: CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, CD44, HLA-ABC, SSEA-4: CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, Sox2, Tra1-60, Tra1-80, FGF-4, CFC-1 ja PROM1.

Transkriptomiikka ja proteomiikka paljastivat keskeisten markkereiden tunnistamisen, joita ilmentävät mm. seuraavat:
AFSCs: Nanog, Sox2, POU5F1, NF2, IGF2, PLAU, OXTR, HHAT, RCS5, CDC2, COL2, TAGLN, Gsn, Anx4, GSTP, CK-19, Vim, Col1 ja Gal; AMSCs:
Koska AFSC:lle ja AMSC:lle ei ole saatavilla yhteistä markkeria, on käytettävä laajempaa markkeripaneelia. Tämä kehottaa myös suorittamaan lisää yksityiskohtaisia array- ja funktionaalisia analyysejä, jotta voidaan määritellä sopivimmat markkerit AFSC:n ja AMSC:n karakterisointia varten.

Interressiristiriita

Tekijät ilmoittavat, että heillä ei ole eturistiriitoja.

By: adminPosted on

Vastaa

Sähköpostiosoitettasi ei julkaista.