- Changes in radiation induced metabolic viability do not correlate with growth inhibition
- Säteilyaltistus lisää aineenvaihdunnallista elinkelpoisuutta lisäämällä mitokondrioiden massaa
- Säteily parantaa metabolista elinkelpoisuutta indusoimalla mitokondrioiden biogeneesiä
- Säteily indusoi mitokondrioiden hyperaktivoitumista
- Säteily indusoi kalsiumin kertymistä mitokondrioihin
- Kalsiumin kertyminen mitokondrioihin johtaa solujen hyperaktiiviseen aineenvaihduntatilaan
Changes in radiation induced metabolic viability do not correlate with growth inhibition
Tutkittaessa säteilyn aiheuttamaa kasvun estoa eri solulinjoissa käyttäen MTT-assayta ja laskemalla solujen lukumäärä, havaitsimme, että metaboliseen elinkelpoisuuteen perustuvista määrityksistä saadut tulokset eivät korreloi todellisen solumäärän kanssa eri ajankohtina säteilyaltistuksen jälkeen. Koska MTT-määritystä käytetään laajalti sen perusteella, että se todella edustaa elinkelpoisten solujen lukumäärää tietyssä näytteessä2,3,4. Tutkimme tätä määritystä vertaamalla MTT-arvoja solujen määrään. Eksponentiaalisesti kasvavat solut altistettiin ionisoivalle säteilylle kasvun estymisen ja metabolisen elinkelpoisuuden analysoimiseksi laskemalla solujen lukumäärät ja tetrzoliumsuolan pelkistyminen formazaaniksi (klassinen MTT-testi; tässä käytetään MTT-indeksiä). Soluja altistettiin ensisijaisesti erilaisille ionisoivan säteilyn annoksille (2, 3, 5 ja 7 Gy), jotta voitiin tarkkailla säteilyannoksesta riippuvia muutoksia ja korrelaatiota solujen lukumäärän ja metabolisen elinkelpoisuuden välillä. Kaikissa kolmessa solulinjassa (A549, MDA-MB-231 ja HeLa) muodostuneen formazaanin määrä (eli MTT-indeksi) väheni 48 tuntia säteilytyksen jälkeen 20-35 prosenttia (5 Gy:n ja 7 Gy:n säteilyannoksilla; täydentävät kuvat 1Ai-Ci) verrattuna säteilyttämättömiin soluihin, kun taas solujen lukumäärän väheneminen oli 70-90 prosenttia (täydentävät kuvat 1Ai-Ci). 1Aii-Cii), mikä osoittaa selvästi, että metabolisen elinkelpoisuuden (MTT-indeksi) ja kasvun eston (solujen lukumäärä) välillä ei ole korrelaatiota kaikilla säteilyannoksilla; nämä kaksi analysoitua säteilyreaktioparametria ovat.
Tämän havainnon yleisyyden tutkimiseksi tarkastelimme lisäksi solujen lukumäärän muutosten (kasvun esto) ja MTT-indeksin (metabolinen elinkelpoisuus) välistä suhdetta seitsemässä ei-tuumorogeenisessa ja tumorogeenisessa solulinjassa (NIH/3T3, Raw 264.7, HEK-293, HeLa, A549, MCF-7 ja MDA-MB-231) yhdellä annoksella (5 Gy), joka aiheutti kolmessa testattavassa solussa melkein 50 %:n kasvun eston (Täydentävä kuva 1). Vuorokauden kuluttua säteilytyksestä kaikki arvioidut solulinjat joko vastasivat kontrollia tai MTT-indeksin arvo nousi (kuvat 1Ai-Gi), paitsi Raw 264.7 (kuva 1Bi), joka on suhteellisen säteilyherkkä. Toisaalta solujen määrä väheni merkittävästi näissä olosuhteissa (kuvat 1Aii-Gii). 48 tuntia säteilytyksen jälkeen solujen lukumäärät olivat merkittävästi pienempiä, 43 prosentista (MDA-MB-231, kuva 1Gii) 76 prosenttiin (Raw 264.7, kuva 1Bii) verrattuna kontrolliin, kun taas MTT-indeksin arvot osoittivat vain 10-37 prosentin vähennystä, ja suurin vähennys oli Raw 264.7-solulinjassa (kuva 1Bi). Kun MTT-indeksin (Δ OD) arvot normalisoitiin vastaavalla solumäärällä, se osoitti 1,4-3-kertaisesti (eri solulinjoissa) lisääntynyttä metabolista elinkelpoisuutta solua kohti (johdetut tiedot) 24 ja 48 tunnin kohdalla, mikä edelleen väheni 48 tunnin kohdalla useimmissa solulinjoissa lukuun ottamatta Raw264.7-, NIH/3T3- ja HeLa-soluja, mutta ne pysyivät huomattavasti korkeampina kuin vastaavat kontrollit (kuvat 1Aiii-Giii). Nämä havainnot osoittavat selvästi, että solujen lukumäärä, joka on säteilyn aiheuttaman kasvun estymisen ja/tai sytotoksisuuden todellinen mittari, ei korreloi säteilyn vasteen nopeassa arvioinnissa laajalti käytetyn metabolista elinkelpoisuutta mittaavan MTT-määrityksen kanssa, mikä näyttäisi johtuvan säteilyn aiheuttamasta lisääntyneestä aineenvaihdunnallisesta elinkelpoisuudesta (kuvio 1). 1Aiii-Giii) altistuneille soluille.
Säteilyn aiheuttaman kasvun eston aliarviointi MTT-testillä. NIH/3T3 (Ai-Aiii), Raw264.7 (Bi-Biii), HEK-293(Ci-Ciii), HeLa (Di-Diii), A549 (Ei-Eiii), MCF-7(Fi-Fiii) ja MDAMB-231(Gi-Giii) analysoitiin MTT-määrityksellä (Ai-Gi) ja solujen lukumäärän arvioinnilla (Nt/N0, Aii-Giii) 5 Gy:n säteilyannoksella. Lisäksi MTT-arvot (ΔOD) normalisoitiin vastaavalla solumäärällä metabolisen elinkelpoisuuden/solun kvantifioimiseksi (Aiii-Giii, johdetut tiedot), ja ne esitettiin moninkertaisena muutoksena kontrolliin nähden eri aikaväleillä. Säteilyn aiheuttama kasvun esto (% -arvo) sekä MTT:n että solujen lukumäärän osalta kvantifioitiin ja mainittiin 48 tunnin kohdalla (kaavion insertti). Tähti osoittaa ryhmien välisen muutoksen tilastollisen merkitsevyyden. Tiedot on ilmaistu keskiarvona ± SD (n = 4) *p < 0,05 vs. säteilyttämättömät solut.
Säteilyaltistus lisää aineenvaihdunnallista elinkelpoisuutta lisäämällä mitokondrioiden massaa
Säteilylle altistuneiden solujen lisääntynyt aineenvaihdunnallinen elinkelpoisuus voi johtua joko hyperaktiivisista mitokondrioista tai lisääntyneestä mitokondrioiden massasta, koska MTT:n muuntuminen formasaaniksi tapahtuu pääasiassa mitokondrioissa7,8,9,10. Ionisoivan säteilyn tiedetään lisäävän mitokondrioiden massaa ja toimintaa altistuneissa soluissa20,21. Tämän vuoksi tutkimme virtaussytometrian avulla, onko lisääntynyt mitokondriomassa vastuussa MTT-indeksin noususta säteilylle altistuneissa soluissa. Aikaisempien havaintojen mukaisesti havaitsimme, että keskimääräinen mitokondrioiden massa solua kohti kasvoi merkittävästi lähes 1,4-kertaiseksi MCF-7:ssä (pienin, kuva 2Fi) ja 4-kertaiseksi Raw 264.7:ssä (suurin, kuva 2Bi) 24 ja 48 tuntia säteilyaltistuksen jälkeen (kuvat 2Ai-Gi). Samanaikaisesti säteilytetyissä soluissa havaittiin myös lisääntynyttä formasaanin tuotantoa solua kohti vastaavina ajankohtina, jotka määriteltiin kvantitatiivisesti samanlaisissa koeolosuhteissa (kuvat 2Aii-Gii). Mikroskooppikuvat 24 tuntia säteilyaltistuksen jälkeen osoittavat myös säteilytetyissä soluissa näkyvästi lisääntynyttä formasaanin kerrostumista kontrolliin verrattuna (kuvat 2Aiii-Giii). Kontrollisoluissa formasaania sisältävät kappaleet (mitokondriot) ovat väriltään vähemmän voimakkaita, harvakseltaan ja tasaisesti sytoplasmassa jakautuneita, kun taas säteilylle altistetuissa soluissa ne olivat väriltään tummia ja ryhmittyneet perinukleaariselle alueelle (kuvat 2Aiii-Giii). Nämä mikroskooppikuvat antavat visuaalista ja tukevaa näyttöä säteilytettyjen solujen korkeammasta MTT-indeksistä tai lisääntyneestä metabolisesta elinkelpoisuudesta solua kohti. Lisäksi ne vahvistavat, miten säteilytettyjen eloonjääneiden solujen vähentynyt määrä voi tuottaa paljon suuremman määrän formasaania (väritiheys) solua kohti kuin vastaavat käsittelemättömät kontrollisolut, mikä johtaa tietojen väärään tulkintaan.
Säteilytys kasvattaa mitokondrioiden massaa solua kohti ja tehostaa formasaanin muodostusta: Mitokondrioiden massa analysoitiin värjäämällä soluja MitoTracker Green FM:llä (100 nM; 20 min) ilmoitetuissa aikapisteissä. Kaaviot Ai- Gi (kuvassa 1 kuvatut solulinjat), jotka osoittavat keskimääräisen fluoresenssin intensiteetin (MFI), joka esitetään moninkertaisena muutoksena kontrolliin nähden. (Aii-Gii) Solua kohti muodostunut formazaani kvantifioitiin spektrofotometrisesti ja esitetään moninkertaisena muutoksena kontrolliin nähden eri solulinjoissa vastaavina ajankohtina. (Aiii-Giii) Mikromikroskooppikuva, jossa näkyy formasaanin kertyminen (20X-objektiivilla) kontrolli- ja säteilytetyissä soluissa, jotka on kuvattu 2 tunnin MTT-inkuboinnin jälkeen 24 tuntia säteilytyksen jälkeen eri solulinjoissa. Yhden säteilytetyn solun zoomauskuva on korostettu, jotta nähdään lisääntynyt pistemäinen formasaanin kerrostuminen. Tiedot on esitetty keskiarvoina ± SD (n = 4) *p < 0,05 vs. käsittelemättömät kontrollisolut.
Säteily parantaa metabolista elinkelpoisuutta indusoimalla mitokondrioiden biogeneesiä
Mitokondriot ovat pääasiallinen paikka, jossa MTT pelkistyy formasaaniksi7,8,9,10, joten mitokondrioiden massan kasvattaminen voi lisätä metabolista elinkelpoisuutta. Lisääntynyt mitokondriomassa säteilytetyissä soluissa voisi johtua kahdesta syystä: ensinnäkin ionisoiva säteily aiheuttaa G2/M-lohkon22,23. G2-vaiheessa pysähtyneillä soluilla on enemmän mitokondrioita22,23,24 , jotka voivat pelkistää enemmän MTT:tä formazaaniksi säteilytetyissä soluissa. Toiseksi ionisoivan säteilyn tiedetään indusoivan mitokondrioiden biogeneesiä20,21 , jolloin mitokondrioiden massa kasvaa. Testataksemme, onko säteilyn indusoima G2/M-pysähdys vai mitokondrioiden biogeneesi vai molemmat vastuussa lisääntyneestä mitokondriomassasta solua kohti säteilytetyissä soluissa, tarkastelimme molempia hypoteeseja peräkkäin. Koska säteilyn aiheuttamaa mitokondriomassan lisääntymistä (kuvat 2Ai-Gi) havaittiin kaikissa solulinjoissa, vain HeLa- ja MDA-MB-231-solut valittiin sattumanvaraisesti, jotta ymmärrettäisiin mekanismit, jotka ovat syynä säteilyn aiheuttamaan lisääntyneeseen aineenvaihdunnalliseen elinkelpoisuuteen.
Solusyklijakauma suoritettiin 24 ja 48 tuntia säteilyn jälkeen. HeLa- ja MDA-MB-231-soluissa havaittiin 24 tunnin kohdalla 17 ja 6 % ylimääräistä solupopulaatiota solusyklin G2/M-fraktiossa. Esto on kuitenkin poistunut kokonaan 48 tunnin kohdalla (kuva 3A), mikä viittaa siihen, että säteilyn aiheuttama solusyklin pysähtyminen voi osittain vaikuttaa lisääntyneeseen mitokondriomassaan 24 tunnin kohdalla mutta ei 48 tunnin kohdalla. On myös tärkeää huomata, että G2/M-vaiheessa olevien solujen lähes 17 %:n lisäys ei voi aiheuttaa 1,9-kertaista (mikä on 90 %:n suuruinen) muutosta mitokondrioiden massassa ja 1,5-kertaista muutosta MTT:n pelkistymisessä formasaaniksi 24 tunnin kuluttua HeLa-soluissa (kuvat 2Di ja Dii). Vaikka solusyklin esto purkautui kokonaan 48 tunnin kohdalla, mitokondrioiden massa ja lisääntynyt metabolinen elinkelpoisuus pysyivät kuitenkin huomattavasti suurempina kuin vastaavissa kontrolleissa. Nämä havainnot eivät tue väitettä, jonka mukaan säteilyn indusoima lisääntynyt metabolinen elinkelpoisuus johtuisi solusyklin pysähtymisen välittämästä lisääntyneestä mitokondriomassasta, kuten aiemmin on raportoitu polyfenoliyhdisteiden hoidon yhteydessä18,25.
Säteilyn indusoima mitokondrioiden biologinen muodostuminen lisää aineenvaihdunnallista elinkykyä: (A) Solusyklihistogrammi, joka osoittaa solujen vaihejakauman (G1, S ja G2/M) 24 ja 48 tuntia säteilytyksen jälkeen HeLa- ja MDA-MB-231-soluissa. (B) Mitokondriogenomin koodaama Leu-tRNA-geeni analysoitiin semi-kvantitatiivisella PCR:llä ja normalisoitiin ydinpol gamma -geenin kopioluvulla. Myös mtDNA:n kopioluku esitetään vertailevana kertaisena muutoksena vastaavissa aikapisteissä (pylväsdiagrammi). (C) Mitokondriaalisen biogeneesin ja mitokondriaalisen kompleksi-II-alayksikön SDH-A:n proteiiniekspressioanalyysi esitetty HeLa- ja MDA-MB-231-soluissa. Ruutujen väliset arvot edustavat 8 ja 24 tuntia säteilytyksen jälkeen tapahtunutta moninkertaista kasvua, joka on kvantifioitu densitometrialla ja normalisoitu vastaavaan β-aktiiniin. DNA- (B) ja proteiiniblottien (C) kuvat on leikattu täyspitkistä bloteista (täydentävät kuvat 2 ja 3). (D) Kloramfenikolin (40 μM; 30 minuuttia ennen IR-altistusta; jatkuva altistus) vaikutuksen analysointi mitokondrioiden pitoisuuteen MitoTracker Green FM:llä ilmoitetuissa aikapisteissä virtaussytometriä käyttäen, ja kuvaajat esitetään keskimääräisen fluoresenssin intensiteetin (MFI) moninkertaisena muutoksena vastaavaan kontrolliin verrattuna. Kloramfenikolin vaikutus säteilyn aiheuttamaan kasvun estoon analysoitiin (5 Gy:llä) MTT-määrityksellä (E) ja solujen lukumäärällä (F) HeLa- ja MDA-MB-231-soluissa. Kasvun estyminen kvantifioitiin ja mainittiin 48 tunnin kohdalla. Tiedot on ilmaistu keskiarvona ± SD kolmoiskappaleista. *p < 0,05 vs. säteilyttämätön kontrolli.
Testataksemme lisäksi hypoteesia, jonka mukaan säteilyn indusoima hypermetabolinen aktiivisuus, joka korreloi lisääntyneen mitokondriomassan kanssa altistuneissa soluissa (kuvat 2Ai-Gi), johtuu säteilyn indusoimasta mitokondrioiden biogeneesistä, analysoimme mtDNA:n kopiolukumäärän kontrolloiduissa ja säteilylle altistuneissa soluissa. Leu t-RNA-geenin kopioluku mitattiin mitokondriogenomin koodaaman mtDNA:n kopioluvun osalta ja normalisoitiin ydinpol-gammalla käyttäen puolikvantitatiivista PCR-menetelmää. Sekä HeLa- että MDA-MB-231-soluissa mtDNA:n kopioluku oli kasvanut 18 ja 31 prosenttia 24 tunnin säteilyaltistuksen jälkeen, ja se kasvoi edelleen 138 prosenttiin HeLa- ja 21 prosenttiin MDA-MB-231-soluissa verrattuna kontrollisoluihin 48 tunnin kuluttua (kuva 3B). Lisäksi tutkimme PGC-1α- (peroksisome proliferaattori-aktivoituneen reseptorin gamma-koaktivaattori 1-alfa) ja TFAM-proteiinien (mitokondriaalinen transkriptiotekijä A) ajasta riippuvaista ilmentymistasoa Western blot -menetelmällä. Nämä kaksi proteiinia ovat solujen mitokondrioiden biogeneesin ja ylläpidon keskeisiä säätelijöitä26,27,28. Mielenkiintoista on, että sekä PGC-1α:n että TFAM:n ilmentymisen (kuva 3C) havaittiin lisääntyvän ajasta riippuvaisesti säteilylle altistuneissa soluissa (HeLa ja MDA-MB-231), mikä korreloi lisääntyneen mitokondriomassan kanssa 24 tunnin aikapisteessä (kuvat 2Di ja Gi). Tarkistimme lisäksi, onko lisääntynyt mitokondriomassa toiminnallinen ja onko siinä lisääntynyt SDH-A-proteiinin ilmentyminen, joka on MTT:n ensisijainen pelkistävä entsyymi formazaaniksi7,8,9,10. SDH-A:n proteiinipitoisuuksien havaittiin myös lisääntyneen 8 ja 24 tunnin säteilyaltistuksen jälkeen (kuva 3C), mikä korreloi lisääntyneen MTT-indeksin tai lisääntyneen metabolisen elinkelpoisuuden kanssa HeLa- ja MDA-MB-231-soluissa (kuvat 1 ja 2). SDH-A-tasojen havaittiin lisääntyneen merkittävästi myös muissa solulinjoissa (tietoja ei ole esitetty). Hypoteesin validoimiseksi todettiin lisäksi, että säteilyn indusoima mitokondrioiden biogeneesi johtaa lisääntyneeseen metaboliseen elinkelpoisuuteen; estimme mitokondrioiden biogeneesin käyttämällä kloramfenikolia29,30. Havaitsimme, että kloramfenikoli ei-toksisena pitoisuutena vähensi merkittävästi säteilyn indusoimaa mitokondrioiden biogeneesiä molemmissa solulinjoissa (kuva 3D).Kun MTT- ja kasvukinetiikka (kuvat 3E ja F) suoritettiin soluille, joita käsiteltiin kloramfenikolilla ennen säteilyaltistusta, se osoitti huomattavasti vähäisempää formazaanin muodostumista kuin pelkkä säteily (kuva 3E), mikä viittaa siihen, että säteilyn indusoima lisääntynyt aineenvaihdunnallinen elinkelpoisuus johtuu pääasiassa mitokondrioiden biogeneesistä. MTT-määrityksen ja solujen laskennan avulla saadun säteilyn aiheuttaman kasvun estokäyrän välinen ero on vain 8 % kloramfenikolilla käsitellyissä soluissa (kuvat 3E ja F), jotka olivat 25 % ja 33 % HeLa- ja MDA-MB-231-soluissa (kuvat 1Di-ii ja Gi-ii). Nämä tulokset vahvistavat hypoteesia, jonka mukaan säteilyn aiheuttama mitokondrioiden massan ja metabolisen elinkelpoisuuden lisääntyminen johtuu suurelta osin säteilyn aiheuttamasta mitokondrioiden biogeneesistä, jota säätelevät säteilyn aiheuttamat PGC-1α ja TFAM.
Säteily indusoi mitokondrioiden hyperaktivoitumista
Aikaisemmissa tuloksissa havaitsimme, että ionisoiva säteily indusoi solujen mitokondriomassaa, mikä näyttää olevan vastuussa aineenvaihdunnallisen elinkelpoisuuden lisääntymisestä (MTT-indeksi) säteilytetyissä soluissa; tiedetään kuitenkin, että säteily indusoi myös yksittäisten mitokondrioiden hyperaktivoitumista säteilytetyissä soluissa31. Sen selvittämiseksi, johtuiko MTT-indeksin paraneminen ainoastaan lisääntyneestä mitokondriomassasta vai myös säteilyn aiheuttamasta mitokondrioiden hyperaktivoitumisesta, mitattiin ΔΨm (mitokondrioiden kalvopotentiaali, MMP) fluoresenssimikroskopialla TMRM:n avulla. Säteilytetyissä soluissa (24 tunnin kohdalla) näkyi kirkkaanpunaisia pistemäisiä mitokondrioita, jotka viittasivat korkeaan ΔΨm:ään verrattuna kontrolliin (kuva 4A). Tämä tulos validoitiin edelleen arvioimalla ΔΨm:n kvantitatiivisesti DiOC6:n avulla virtaussytometrialla. HeLa-solut osoittivat 2,4-2,8-kertaisesti lisääntynyttä MMP:tä, mutta MDA-MB-231-solut osoittivat 1,3-kertaisia muutoksia säteilyn indusoimassa MMP:ssä molempina ajankohtina (kuva 4B). Tämä korkea mitokondrioiden kalvopotentiaali korreloi säteilytettyjen solujen jokaisessa mitokondriossa tapahtuvan moninkertaisen formazaanin muodostumisen kanssa (kuvan 2Aiii sisäkuva), mikä viittaa hyperkompleksi II:n (SDH) aktiivisuuteen (kuvat 2Aii-Gii), mikä johtuu todennäköisesti säteilyn aiheuttamasta lisääntyneestä ΔΨm:stä. Tämä havainto on yhdenmukainen muissa tutkimuksissa aiemmin tehtyjen havaintojen kanssa, joiden mukaan kompleksi II on tehokkaampi muodostamaan ja ylläpitämään ΔΨm:ää stressitilanteissa32,33. Hyperaktiivisen kompleksi II:n aiheuttama lisääntynyt ΔΨm takaa myös muiden mitokondriaalisten dehydrogenaasien lisääntyneen aktiivisuuden, mikä saattaa osaltaan vaikuttaa muidenkin kuin SDH:n lisääntyneeseen formazaaninmuodostukseen.
Säteily indusoi mitokondrioiden hyperaktivoitumista: (A) Fotomikrografiakuvat, joissa näkyy mitokondrioiden kalvopotentiaali (MMP) HeLa- ja MDA-MB-231-soluissa, jotka on värjätty TMRM:llä (5 nM/ml; 30 min; 37 °C) 24 tuntia säteilytyksen jälkeen. Säteilyn aiheuttamat muutokset mitokondrioiden MMP:ssä kvantifioitiin DiOC6:lla (B) ja superoksidiradikaali kvantifioitiin MitoSoxilla (C) HeLa- ja MDA-MB-231-soluissa virtaussytometrillä, ja ne esitetään MFI-kertaisena muutoksena ilmoitetuissa aikapisteissä kontrolliin nähden. Tähti osoittaa muutoksen tilastollista merkitsevyyttä ilmoitettujen ryhmien välillä. Tiedot on ilmaistu keskiarvona ± SD kolminkertaisista näytteistä. *p < 0,05 vs. säteilyttämätön kontrolli.
Sukkinaattiohjatun hapettumisen kompleksi-II:n (SDH) välityksellä on todettu edistävän merkittävästi lisääntynyttä mitokondriaalista ROS:n muodostumista34. Siksi analysoimme mitokondrioiden superoksiditasoa kontrolli- ja säteilytetyissä soluissa testataksemme, että hypermetabolisesti aktiivisten mitokondrioiden pitäisi tuottaa enemmän superoksidiradikaaleja. MitoSoxilla (mitokondriaalinen ROS-indikaattori) värjätyt solut analysoitiin virtaussytometrillä. Säteilytetyissä soluissa MitoSoxin fluoresenssi oli huomattavasti suurempi kuin vastaavissa kontrolleissa. Molemmissa solulinjoissa mitokondriaalisen ROS:n määrä kasvoi lähes 1,25-kertaiseksi 24 tunnin kohdalla, mutta se kasvoi edelleen 1,65-kertaiseksi HeLa-soluissa ja 1,5-kertaiseksi MDA-MB-231-soluissa 48 tunnin kohdalla säteilyaltistuksen jälkeen (kuva 4C). Koska mitokondriaalinen dehydrogenaasi SDH on tärkein MTT-pelkistyksen aiheuttaja7,8,9,10, nämä tulokset vahvistavat havainnon, jonka mukaan lisääntynyt ROS on suoraan verrannollinen lisääntyneeseen SDH-aktiivisuuteen34. Nämä tulokset viittaavat siihen, että lisääntynyt mitokondriomassa koostuu toiminnallisesti hyperaktiivisista mitokondrioista, jotka vähentävät suuremman määrän MTT:tä formazaaniksi solua kohti säteilytetyissä näytteissä.
Säteily indusoi kalsiumin kertymistä mitokondrioihin
Ionisoiva säteily häiritsee solujen kalsiumhomeostaasia, mikä johtaa kalsiumin lisääntyneeseen vapautumiseen endoplasmisesta retikulumista (ER) sytoplasmaan, jota sitten puskuroivat solujen perinukleaarisella alueella olevat toiminnalliset mitokondriot35,36. Muuttunut kalsiumhomeostaasi indusoi myös ROS:n (reaktiiviset happilajit) tuotantoa ja mitokondrioiden biogeneesiä35,36,37.
Tutkittaessa, johtuuko 24 ja 48 tunnin kohdalla havaittu lisääntynyt metabolinen elinkelpoisuus sytoplasman ja mitokondrioiden kohonneista Ca2+-tasoista, arvioitiin vapaata solu- ja mitokondrioiden Ca2+:ta. Kontrolli- ja käsitellyt solut värjättiin Fluo-3AM:lla (Ca2+-indikaattori) ja Rhod-2AM:lla (spesifinen mitokondriaalinen Ca2+-indikaattori)38 vastaavina ajankohtina ja analysoitiin virtaussytometrillä. Säteilyllä säteilytetyissä soluissa havaittiin merkittävä kalsiumtason nousu, joka lisääntyi lähes 1,4-kertaiseksi (40 %) molemmissa tutkituissa solulinjoissa (HeLa ja MDA-MB-231), mihin viittasi Fluo-3:n lisääntynyt fluoresenssi 8 tunnin kohdalla, joka vähenee marginaalisesti 24 tunnin kohdalla (kuva 5A). Mielenkiintoista on, että säteilyn aiheuttama mitokondriaalisen Ca2+:n lisääntyminen (2,4-kertainen HeLassa ja 1,6-kertainen MDA-MB-231:ssä, kuva 5B) oli vieläkin voimakkaampaa. Tämä havainto varmistettiin edelleen visualisoimalla värjätyt solut fluoresenssimikroskoopilla. Mitotracker Redillä, Fluo-3AM:lla ja Rhod-2AM:lla värjätyt solut havaittiin itsenäisesti 24 tuntia sädehoidon jälkeen. Fluo-3AM ja Rhod-2AM osoittivat molemmat voimakasta perinukleaarista pistemäistä fluoresenssia, jolla oli sama kuvio kuin mitotracker-punaisella säteilylle altistetuissa vastaavissa soluissa (kuva 5C), mikä viittaa siihen, että lisääntynyt sytoplasminen Ca2+ on kerääntynyt mitokondrioihin. Lisäksi mitokondrioiden spesifiset Ca2+ -signaalit Rhod-2AM-värjätyissä soluissa vahvistavat tämän havainnon. Mielenkiintoista on, että MDA-MB-231-soluissa oli jo kontrollisoluissa korkea mitokondrioiden Ca2+ -pitoisuus (Rhod-2-AM-värjäys) ja perinukleaarinen mitokondrioiden klusteroituminen (Mitotracker Red -värjäys), joka lisääntyy entisestään säteilytyksen jälkeen, ja tämä voi olla syy siihen, miksi tässä solussa säteilyn indusoima mitokondrioiden biogeneesin ja formazaanin muodostumisen lisääntyminen oli vähäisintä. Olemme osoittaneet aiemmassa tutkimuksessamme, että säteily aiheuttaa Ca2+:n kertymistä mitokondrioihin, mikä johtaa mitokondrioiden vaurioitumiseen ja mitofagiaan36. Mitokondriot, joissa on korkea Ca2+ -pitoisuus ja kohonnut mitokondrioiden kalvopotentiaali, kerryttävät enemmän A23187:ää ja osoittavat kirkkaampaa fluoresenssia mikroskoopissa UV-herätteellä. Pysyvästi vaurioituneissa mitokondrioissa on kuitenkin erittäin korkea fluoresenssi, ja ne näkyvät pyöreinä kappaleina solun sisällä36. Havainnoidaksemme Ca2+:n kertymistä mitokondrioihin näissä koeolosuhteissa värjäsimme kontrolli- ja säteilytetyt HeLa- ja MDA-MB-231-solut 24 tunnin kuluttua altistuksesta (kuva 5C). Säteilyllä säteilytetyissä soluissa havaittiin myös suurempi ruumiiden kertyminen, mikä osoittaa säteilyn aiheuttamia vaurioituneita mitokondrioita. Säteilyllä säteilytetyissä soluissa näkyy enemmän Mitotracker Red-, Fluo-3AM- ja Rhod-2AM-fluoresenssia perinukleaarisella alueella (kuva 5C), jossa mitokondriot muodostavat verkoston endoplasmisen retikulumin (ER) kanssa ja keräävät suurimman osan stressin aiheuttamasta Ca2+ -vuodosta ER:stä ja suojaavat soluja kuolemalta39. Tämä havainto viittaa siihen, että säteilyaltistuksen jälkeen varastoista vapautuva Ca2+ kertyy pääasiassa mitokondrioihin. Aiemmin on raportoitu, että korkea Ca2+ mitokondriomatriisissa lisää SDH:n aktiivisuutta40. Siksi korreloimme, että mitokondrioihin kertynyt Ca2+ lisäsi SDH-kompleksin aktiivisuutta, mikä johti hyperaktiivisiin mitokondrioihin ja lisääntyneeseen metaboliseen elinkelpoisuuteen säteilylle altistuneissa soluissa.
Säteily indusoi mitokondriaalisen Ca2+:n kertymistä: (A ja B) Pylväsdiagrammi osoittaa Ca2+-pitoisuuden muutoksen HeLa- ja MDA-MB-231-soluissa, jotka on värjätty Fluo-3 AM:lla (5 µM; 30 min) ja Rhod-2 AM:lla (1 µM; 20 min; 37 °C), analysoitu virtaussytometrillä. MFI-kertainen muutos esitetään tässä 8 ja 24 tuntia säteilytyksen jälkeen suhteessa kontrolliin. (C) Fotomikrografiassa esitetään säteilyn aiheuttama muutos mitokondrioissa käyttämällä MitoTracker® Rediä ja Ca2+:n solujakauma Fluo-3AM:lla värjättynä ja mitokondrioiden kalsiumin jakautuminen Rhod-2 AM:llä, fluoresoivilla koettimilla. Rhod-2 AM-värjättyjen yksittäisten solujen suurennetut kuvat on korostettu, jotta säteilyn aiheuttama mitokondriaalisen Ca2+:n kertyminen olisi paremmin havaittavissa. Neljäs rivi esittää A23187:lla (6 µM, 30 min) värjättyjä soluja, joissa näkyy Ca2+ -kuormitettuja mitokondrioita HeLa- ja MDA-MB-231-soluissa. Kuvat on otettu fluoresenssimikroskoopilla 40X-objektiivilla.
Kalsiumin kertyminen mitokondrioihin johtaa solujen hyperaktiiviseen aineenvaihduntatilaan
Todistaaksemme Ca2+:n roolin lisääntyneessä formasaaninmuodostuksessa testasimme lisäksi, voiko pelkkä soluissa esiintyvä Ca2+:n aiheuttama häiriö lisätä metabolista elinkelpoisuutta. Tämän väitteen testaamiseksi soluja käsiteltiin Ca2+-ionoforilla A23187 (2 µM, joka lisää sytoplasmisen Ca2+:n määrää, samoin kuin ionisoiva säteily) 1 tunnin ajan ja analysoitiin aineenvaihdunnan elinkelpoisuus 4, 8 ja 24 tuntia käsittelyn jälkeen. Mielenkiintoista oli, että A23187:llä käsitellyt solut osoittivat merkittävästi (1,6-kertaisesti) lisääntynyttä metabolista elinkelpoisuutta solua kohti 8 & 24 tuntia HeLassa ja 4 & 8 tuntia MDA-MB-231:ssä (kuva 6A), käsittelyn jälkeen. Nämä tulokset viittaavat siihen, että lisääntynyt sytoplasminen Ca2+ lisää metabolista elinkelpoisuutta lisäämällä Ca2+:n kertymistä mitokondrioihin (kuva 5C). Tarkistimme myös, voiko Ca2+:n kertymisen estäminen mitokondrioihin haitata säteilyn aiheuttamaa mitokondrioiden massan kasvua. Mielenkiintoista oli, että solut, joita käsiteltiin mitokondriaalisen Ca2+-uniporterin inhibiittorilla, Rutenium Redillä (RuR, joka estää Ca2+:n kertymistä mitokondrioihin), osoittivat huomattavasti vähäisempää mitokondriomassan lisääntymistä (säteilyn indusoimaa) verrattuna pelkkään säteilyn aiheuttamaan lisääntymiseen (kuva 6B). Tiedetään, että lisääntynyt Ca2+ indusoi mitokondrioiden biogeneesiä CaMKII:n (kalmoduliinikinaasi-II)37,41 kautta, joka on myös mitokondriossa asuva proteiini, jonka tiedetään säätelevän PGC-1α:n ilmentymistä37,41,42. Näin ollen voimme päätellä, että Ca2+:n kertymisen estäminen mitokondrioihin ruteniumpunaisella vähensi mitokondrioiden massaa todennäköisesti estämällä mitokondrioiden biogeneesiä. Lisäksi validoidaksemme, johtaako säteilyn aiheuttama lisääntynyt sytoplasman Ca2+ ja sen kertyminen mitokondrioihin lisääntyneeseen metaboliseen elinkelpoisuuteen säteilytetyissä soluissa, käsittelimme soluja BAPTA-AM:llä (solunsisäinen kalsiumkelaattori) ja RuR:llä 30 minuuttia ennen säteilytystä. Sekä lisääntyneen sytoplasmisen Ca2+:n kelaatio BAPTA-AM:llä (kuva 6C) että Ca2+:n kertymisen estäminen mitokondrioihin RuR:llä (kuva 6D) kumosivat molemmat säteilyn aiheuttamaa lisääntynyttä metabolista elinkelpoisuutta 24 ja 48 tunnin säteilytyksen jälkeen HeLa- ja MDA-MB-231-soluissa (kuvat 6C ja D). Nämä tulokset viittaavat siihen, että säteilyn aiheuttamalla Ca2+ – homeostaasin häiriöllä on myös tärkeä rooli mitokondrioiden hyperaktivoitumisessa ja lisääntyneessä metabolisessa elinkelpoisuudessa, luultavasti mitokondrioiden biogeneesiä edeltävässä vaiheessa.
Kalsiumin rooli lisääntyneessä metabolisessa elinkelpoisuudessa: (A) Soluja käsiteltiin A23187:lla (2 µM; 1 h) ER:ään varastoituneen Ca2+:n vapauttamiseksi 4, 8 ja 24 tunnin ajan ja MTT-indeksi mitattiin MTT-määrityksellä HeLa- ja MDA-MB-231-soluista. Tulos esitetään metabolisen elinkelpoisuuden/solu-kertaisena muutoksena ja normalisoituna kontrolliin nähden. (B) Mitokondrioiden pitoisuus analysoitiin virtaussytometrillä käyttäen MitoTracker Green -menetelmää ruteniumpuna-ainetta (1 µM, jatkuva altistus) käsitellyissä soluissa, ja se esitetään suhteellisena kertaisena muutoksena kontrolliin nähden. (C ja D) HeLa- ja MDA-MB-231-soluja käsiteltiin Ca2+ -kelaattorilla BAPTA-AM (20 µM 2 tunnin ajan) ja Ruthenium Redillä ennen säteilytystä, minkä jälkeen mitattiin aineenvaihdunnallinen elinkelpoisuus, ja se esitettiin kerrannaismuutoserona kontrolliin nähden. Tiedot esitetään neljän riippumattoman kokeen keskiarvoina ± SD *p < 0,05 vs. kontrolli.