Kirjahylly

Monet peptidien biogeneesiin osallistuvat entsyymit on tunnistettu

Kuvassa 18-5 on esitetty esiasteiden prosessoinnin yleisimmät vaiheet ja niihin osallistuvat entsyymit. Mukana olevat endoproteaasit ovat prohormonikonvertaasit 1 ja 2 (PC1 ja PC2), eksopeptidaasi on karboksypeptidaasi E (CPE, jota kutsutaan myös CPH:ksi ja enkefaliinikonvertaasiksi) ja α-amidoiva entsyymi on peptidyyliglysiiniä α-amidoiva mono-oksigenaasi (PAM). Monet niiden biosynteesin vaiheet eivät ole ainutlaatuisia neuropeptideille, kuten signaalipeptidin pilkkominen, disulfidisidosten muodostuminen, N- ja O-sidonnaisten oligosakkaridien lisääminen ja myöhempi modifiointi, fosforylaatio ja sulfatointi. Kuten kuvassa 18-3 on esitetty, monet translaation jälkeisistä vaiheista tapahtuvat, kun kypsyvät neuropeptidit kulkevat aksonia pitkin kohti synapsia LDCV:ssä. Neuropeptidien biosynteesin myöhemmät vaiheet (kuva 18-5) ovat ainutlaatuisia neuroneille ja endokriinisille soluille.

Neuropeptidien biosynteesin keskeisiä entsyymejä ovat endoproteaasit, eksoproteaasit ja peptidien päitä muokkaavat entsyymit. Kex2p:n, endoproteaasin, joka pilkkoo hiivan pro-α-parittelutekijän tuottaakseen neljä kopiota feromonista α-parittelutekijää (kuva 18-2), löytäminen ja karakterisointi olivat avainasemassa nisäkkäiden prohormonikonvertaasien, kuten furiinin, PC1/3:n, PC2:n, PC4:n, PC5/6:n, PC7/8/LPC:n ja PACE4:n, löytämisessä. Prohormonikonvertaasit ovat homologisia bakteerien subtilisiinien kanssa, ja niillä on Asp-His-Ser-katalyyttinen triadi, joka koostuu kolmesta katalyysiin osallistuvasta keskeisestä aminohaposta (merkitty D, H ja S kuvassa 18-5). Kunkin proteaasin proregion (kuva 18-5) on oltava läsnä biosynteesin aikana, jotta proteaasi taittuu oikein, mutta se on poistettava, jotta saadaan aktivoitu proteaasi. PC1:n ja furiinin osalta proregionin poistuminen tapahtuu muutaman minuutin kuluessa biosynteesistä entsyymin ollessa endoplasmisessa retikulumissa, ja se on todennäköisesti autokatalyyttinen tapahtuma. Muilla prohormonikonvertaaseilla proregionin poistuminen on paljon hitaampaa. Aktiivisen PC2:n ilmentyminen edellyttää peptidi 7B2:n samanaikaista ilmentymistä (kuva 18-5), joka näyttää toimivan chaperonina ja saattaa myös estää PC2:n endoproteolyyttisen aktiivisuuden ilmentymisen siihen asti, kunnes PC2 on laskeutunut sekretorisiin rakeisiin. Muille prohormonikonvertaaseille ei ole tunnistettu vastaavaa chaperoni-inhibiittoripeptidiä.

Nisäkkäiden endoproteaasit, jotka selvimmin osallistuvat neuropeptidien prosessointiin, ovat PC1 ja PC2, Ca2+-riippuvaiset proteaasit, joita esiintyy sekretorisissa granuloissa ja joiden ilmentyminen rajoittuu neuroneihin ja endokriinisiin soluihin (Kuva 18-5). Useat muut tämän endoproteaasiperheen jäsenet ekspressoituvat laajemmin, kun taas toiset ekspressoituvat rajoitetuissa paikoissa, jotka ovat erillään neuroneista ja endokriinisistä soluista. Esimerkiksi furiinia esiintyy käytännöllisesti katsoen kaikissa soluissa, ja se on lokalisoitunut pääasiassa trans-Golgi-verkkoon; furiini katalysoi peptidien toiminnalle tärkeitä pilkkomisia, kuten ELH:n, hermokasvutekijän ja lisäkilpirauhashormonin esiasteiden alkuperäistä pilkkomista sekä insuliinireseptorin esiasteen sisäistä pilkkomista reseptorin aktiivisen αβ-dimeerimuodon tuottamiseksi. Furiinilla voi olla merkitystä myös joidenkin muiden prosessointientsyymien, kuten PC2:n ja CPE:n, aktivoinnissa.

PC1 ja PC2 pilkkovat peptidiprekursorien valittuja emäksisiä aminohappopareja: Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys ja Arg-Lys. PC1 voi myös katalysoida pilkkomista valituissa yksittäisissä Arg-kohdissa, joita esiintyy joissakin esiasteissa, kuten prosomatostatiinissa ja prokolekystokiniinissä. PC:n suorittamat pilkkomiset LDCV:ssä ovat tiukasti kontrolloituja, ja ne tapahtuvat usein hyvin hallitusti (kuva 18-6). POMC:n ensimmäiset pilkkoutumiset tapahtuvat alle 1 tunnissa (kuva 18-6, vaiheet 1 ja 2), kun taas muut pilkkoutumiset tapahtuvat vasta useiden tuntien kuluttua (kuva 18-6, vaiheet 6 ja 7). Propeptidien endoproteolyyttinen pilkkoutuminen on usein nopeutta rajoittava reaktio peptidien biosynteettisessä prosessoinnissa.

PC1:n, PC2:n ja furiinin katalysoimien pilkkomisten malli, kun ne ilmentyvät neuroneissa ja endokriinisissä soluissa, on paljon valikoivampi kuin pilkkomisten malli, joka on nähtävissä puhdistetuilla entsyymeillä suoritetuissa koeputkikokeissa. Vaikka esimerkiksi prohormonikonvertaasit yleensä pilkkovat mallipeptidisubstraattien emäksisten jäännösparien COOH-terminaalissa, soluissa pilkkoutuminen voi tapahtua emäksisten jäännösparien keskellä, kuten POMC:n pilkkoutumisessa (kuva 18-6), jossa emäksiset jäännökset erotetaan toisistaan ja ne jäävät kahteen tuloksena syntyvään kypsään peptidiin . On todennäköistä, että LDCV:n Ca2+ -pitoisuus ja sisäinen pH ovat kaksi muuttujaa, joita neuronit ja endokriiniset solut käyttävät säätelemään endoproteolyyttistä aktiivisuutta LDCV:ssä.

Lisäisillä endoproteaaseilla voidaan osoittaa olevan merkitystä neuropeptidien biosynteesissä. Johtavia ehdokkaita ovat hiivan aspartyyliproteaasi-3:n (YAP-3) nisäkäshomologi ja N-arginiinidibasiinikonvertaasi (NRD) . Peptidien biosynteesin lisäkierre nähdään sydämessä, jossa proatriureettinen tekijä (proANF) varastoituu LDCV:iin, mutta kypsä ANF vapautuu eteissoluista verenkiertoon. ProANF:n prosessointiin, johon liittyy pilkkoutuminen proANF:n yhden Arg-jäämän jälkeen, ei voi osallistua PC1 tai PC2, koska näitä PC:tä on sydämessä häviävän vähän.

CPE on liukoinen proteiini, jota esiintyy lähes kaikissa LDCV:ssä neuroneissa ja endokriinisissä soluissa (kuva 18-5) . Se poistaa prohormonikonvertaasien tuottamien peptidivälituotteiden COOH-terminaaleista emäksiset jäännökset, Lysin tai Argin. Se tunnistettiin alun perin sen kudosjakauman ja substraattispesifisyyden sekä sen spesifisen eston perusteella guanidinoetyylimetyylimerkaptosokiinihapolla (GEMSA). CPE on Co2+- ja Zn2+-aktivoituva entsyymi, jolla on lyhyt proregio, joka tavallisesti poistetaan entsyymin kypsymisen aikana; toisin kuin prohormonikonvertaasit, CPE on aktiivinen proregion ollessa kiinni. Peptidien prosessoinnin karboksypeptidaasifunktio ei yleensä ole nopeutta rajoittava, koska COOH-terminaalisia emäksisiä jäämiä sisältäviä peptidivälituotteita havaitaan vain erittäin pieninä pitoisuuksina kudoksissa tai LDCV-uutteissa. Viime aikoina on tunnistettu muitakin karboksypeptidaaseja, erityisesti CPD, entsyymin integraalinen kalvomuoto, jolla on kolme karboksypeptidaasidomeenia. CPE:n ja näiden muiden karboksypeptidaasien suhteellinen merkitys neuropeptidien prosessoinnissa in vivo on epäselvä. Kun otetaan huomioon, että pilkkominen emäksisen jäännösparin kohdalla voi tapahtua parin keskellä, on syytä olettaa, että LDCV:stä löytyy aminopeptidaasi.

PAM on bifunktionaalinen entsyymi, jota löytyy lähes kaikista LDCV:istä (kuva 18-5) . PAM vaikuttaa peptidisubstraatteihin endoproteolyyttisen pilkkomisen ja eksopeptidaasin vaikutuksen jälkeen, kun COOH-terminaalinen Gly-jäännös on paljastunut, ja muuntaa peptidyyli-Gly:n vastaavaksi peptidi-NH2:ksi. Noin puolet tunnetuista bioaktiivisista peptideistä on α-amidoituja, ja α-amidointi on yleensä ratkaisevan tärkeää biologisen tehon kannalta. Peptidyyli-Gly- ja peptidi-COOH-muodot ovat yleensä inaktiivisia fysiologisissa pitoisuuksissa. α-amidaatioreaktion ensimmäisen vaiheen suorittaa peptidyyliglysiiniä α-hydroksyloiva mono-oksigenaasi (PHM), joka on bifunktionaalisen PAM-proteiinin NH2-terminaalinen osa. PHM sitoo kaksi Cu2+-atomia, jotka osallistuvat katalyysiin käymällä läpi pelkistys- ja hapetussyklejä. PHM käyttää pelkistysaineena askorbiinihappoa, ja yksi happiatomi O2:sta liitetään peptidiin hydroksylaatiovaiheen aikana. Näin ollen PHM on entsymaattisesti hyvin samankaltainen kuin dopamiinin β-mono-oksigenaasi (DBM), joka muuttaa dopamiinin noradrenaliiniksi (ks. luku 12). α-amidaatioreaktion toisen vaiheen suorittaa PAM:n toinen entsyymidomeeni, peptidyyli-α-hydroksiglysiiniä α-amidoiva lyaasi (PAL). PAL-domeeni muodostaa uudenlaisen, kaksiarvoisista metalli-ioneista riippuvaisen entsyymin. Neuronit ilmentävät ensisijaisesti bifunktionaalisen PAM-proteiinin integraalista kalvomuotoa (kuva 18-5), kun taas mRNA:n lisäsplikointi mahdollistaa sen, että jotkin endokriiniset solut voivat ilmentää proteiinin liukoisia versioita, joista puuttuu transmembraanidomeeni. PAM:n integraalimembraanimuodoissa lyhyt COOH-terminaalinen domeeni ulottuu sytoplasmaan ja osallistuu PAM:n reititykseen LDCV:iden ja solun pinnan välillä. Pelkistyneen askorbaatin tarjontaa LDCV:ssä ylläpitää sytokromi B561, proteiini, jolla on viisi transmembraanidomeenia ja joka kuljettaa elektroneja sytosolisesta askorbaatista askorbaattiin LDCV:n luumenissa. Sytokromi B561 löytyy myös katekoliamiinia sisältävistä vesikkeleistä, joissa sillä on samanlainen tehtävä DBM:lle (ks. luku 12). Hermo- ja hormonikudokset ylläpitävät pelkistetyn askorbaatin pitoisuuksia noin 100-kertaisina veren askorbaattipitoisuuteen verrattuna, kun taas useimmat muut kudokset eivät konsentroi askorbaattia.

Monissa peptideissä on NH2-terminaalisia pyroglutamiinihappojäännöksiä, joita kutsutaan myös sykliseksi glutamiinihapoksi (<Glu) ja jotka ovat välttämättömiä bioaktiivisuuden kannalta, esimerkiksi tyrotropiinia vapauttavalla hormonilla (TRH) ja gonadotropiinia vapauttavalla hormonilla (GnRH). Tästä vaiheesta vastaava entsyymi on glutaminyylisyklaasi, joka muuttaa alkuperäisen NH2-päätteisen Gln:n <Glu:ksi. Glutaminyylisyklaasin säätelyä ja toimintaa ei ole vielä tutkittu laajasti. Toinen tärkeä mutta harvinainen peptidien modifikaatio on α-N-asetylaatio (kuvat 18-6 ja 18-7). POMC-prosessoinnin aikana α-N-asetyloituminen lisää huomattavasti ACTH(1-13)NH2:n ihoa tummentavaa tehoa ja poistaa samalla sekä ACTH:n lisämunuaisen steroidogeenisen tehon että β-endorfiinin opiaattiaktiivisuuden. Tästä modifikaatiosta vastuussa olevaa entsyymiä tai entsyymejä ei ole vielä puhdistettu tai kloonattu.

Kuvassa 18-6 esitetään esimerkkinä prosessointivaiheiden malli POMC-järjestelmässä . Ensimmäiset endoproteolyyttiset vaiheet (kuva 18-6, vaiheet 1-4) ovat PC1:n välittämiä, ja niitä esiintyy kaikissa POMC:tä tuottavissa neuroneissa ja endokriinisissä soluissa yleensä esitetyssä numerojärjestyksessä. On selvää, että vaiheet 1 ja 2 käynnistyvät trans-Golgi-verkossa ja jatkuvat LDCV:ssä, kun taas vaihe 4 tapahtuu vain LDCV:ssä. Vaiheet 5-7 tapahtuvat vain LDCV:ssä ja näyttävät edellyttävän PC2:ta. Aikuisen aivolisäkkeen etuosassa kortikotroopit sisältävät PC1:tä mutta eivät PC2:ta ja suorittavat vain vaiheet 1-4. Varhaisen postnataalisen kehityksen aikana kortikotroopit kuitenkin ilmentävät myös PC2:ta, ja vaiheet 5-7 näkyvät ohimenevästi kortikotroopeissa. Rotalla PC2:n ilmentyminen ja ACTH:n sisäinen pilkkominen (pilkkominen 5) vähenevät samanaikaisesti muutama viikko syntymän jälkeen, suunnilleen samaan aikaan, kun ACTH:n aikuisen mallin mukainen lisämunuaisen steroidogeneesin kontrollointi ilmenee.

Melanotroopit ja POMC:tä tuottavat keskushermoston neuronit ilmentävät sekä PC1:tä että PC2:ta, ja näin ollen pienempiä peptidituotteita nähdään näissä soluissa. PAM ilmentyy kaikissa POMC:tä tuottavissa soluissa, joten liittymispeptidin (JP), pienen peptidin, jolla ei ole selvää biologista funktiota, α-amidaatio tapahtuu nopeasti kaikissa POMC-soluissa (kuva 18-6). Väliaivolisäkkeen melanotroopeissa ja yksinäistiehyen ytimen POMC-neuroneissa tapahtuu ACTH(1-13)NH2:n ja β-endorfiinin α-N-asetylaatiota. Melanotroopeissa ACTH:n α-N-asetylaatio voi tapahtua ennen pilkkoutumista 5. Kuten kuvasta 18-4 käy ilmi, tehdyt erityiset pilkkomiset ja peptidituotteiden NH2- ja COOH-terminaaleihin tehdyt modifikaatiot määräävät vapautuvien bioaktiivisten peptidien seoksen.