Van ’t Hoff saavutti varhaisimman maineensa orgaanisen kemian alalla. Vuonna 1874 hän selitti optisen aktiivisuuden ilmiön olettamalla, että hiiliatomien ja niiden naapureiden väliset kemialliset sidokset suuntautuvat säännöllisen tetraedrin kulmiin. Tämä kolmiulotteinen rakenne selitti luonnossa esiintyvät isomeerit. Hän jakaa kunnian tästä ranskalaisen kemistin Joseph Le Belin kanssa, joka itsenäisesti keksi saman ajatuksen.
Kolme kuukautta ennen tohtorintutkinnon suorittamista Van ’t Hoff julkaisi tämän teorian, jota nykyään pidetään stereokemian perustana, ensin hollantilaisessa pamfletissa syksyllä 1874 ja sitten seuraavana toukokuussa pienessä ranskalaisessa kirjassa La chimie dans l’espace. Saksankielinen käännös ilmestyi vuonna 1877, jolloin Van ’t Hoffin ainoa työpaikka oli Utrechtin eläinlääkärikoulu. Näinä alkuvuosina tiedeyhteisö jätti hänen teoriansa suurelta osin huomiotta, ja yksi merkittävä kemisti, Hermann Kolbe, arvosteli sitä jyrkästi. Kolbe kirjoitti:
”Utrechtin eläinlääketieteellisen koulun tohtori J. H. van ’t Hoff ei ilmeisesti pidä tarkasta kemiallisesta tutkimuksesta. Hän on katsonut mukavammaksi nousta Pegasuksen selkään (ilmeisesti eläinlääketieteelliseltä koululta lainattu) ja julistaa teoksessaan ’La chimie dans l’espace’, kuinka rohkeassa lennossaan kemiallisen Parnassoksen huipulle atomit näyttivät hänen mielestään järjestäytyneen kosmisessa avaruudessa.”
Noin vuoteen 1880 mennessä Van ’t Hoffin teorian tukeminen sellaisilta merkittäviltä kemisteiltä kuin Johannes Wislicenus ja Viktor Meyer toi kuitenkin tunnustusta.
Vuonna 1884 Van ’t Hoff julkaisi kemiallisen kinetiikan tutkimuksensa nimellä Études de Dynamique chimique (”Tutkimuksia kemiallisesta dynamiikasta”), jossa hän kuvasi uuden menetelmän reaktion järjestyksen määrittämiseksi grafiikan avulla ja sovelsi termodynamiikan lakeja kemiallisiin tasapainoihin. Hän esitteli myös kemiallisen affiniteetin nykyaikaisen käsitteen. Vuonna 1886 hän osoitti samankaltaisuuden laimeiden liuosten ja kaasujen käyttäytymisen välillä. Vuonna 1887 hän perusti yhdessä saksalaisen kemistin Wilhelm Ostwaldin kanssa vaikutusvaltaisen tieteellisen lehden nimeltä Zeitschrift für physikalische Chemie (”Fysikaalisen kemian lehti”). Hän työsti Svante Arrheniuksen teoriaa elektrolyyttien dissosioitumisesta ja esitti vuonna 1889 fysikaaliset perustelut Arrheniuksen yhtälölle. Vuonna 1896 hänestä tuli Preussin tiedeakatemian professori Berliinissä. Hänen Stassfurtin suolaesiintymiä koskevat tutkimuksensa olivat tärkeä panos Preussin kemianteollisuudelle.
Van ’t Hoffista tuli Utrechtin eläinlääketieteellisen korkeakoulun kemian ja fysiikan lehtori. Sen jälkeen hän työskenteli kemian, mineralogian ja geologian professorina Amsterdamin yliopistossa lähes 18 vuotta ennen kuin hänestä tuli lopulta kemian laitoksen puheenjohtaja. Vuonna 1896 Van ’t Hoff muutti Saksaan, jossa hän päätti uransa Berliinin yliopistossa vuonna 1911. Vuonna 1901 hän sai ensimmäisen kemian Nobel-palkinnon liuoksia koskevasta työstään. Hänen työnsä osoitti, että hyvin laimeat liuokset noudattavat matemaattisia lakeja, jotka muistuttavat läheisesti kaasujen käyttäytymistä kuvaavia lakeja.