Yksi entsyymien ominaisuuksista, jotka tekevät niistä niin tärkeitä diagnostisina ja tutkimusvälineinä, on niiden spesifisyys suhteessa katalysoimiinsa reaktioihin. Muutamilla entsyymeillä on absoluuttinen spesifisyys, eli ne katalysoivat vain yhtä tiettyä reaktiota. Toiset entsyymit ovat spesifisiä tietyntyyppiselle kemialliselle sidokselle tai funktionaaliselle ryhmälle. Yleisesti ottaen on olemassa neljä erilaista spesifisyyttä:
- Absoluuttinen spesifisyys – entsyymi katalysoi vain yhtä reaktiota.
- Ryhmäspesifisyys – entsyymi toimii vain molekyyleihin, joilla on tiettyjä funktionaalisia ryhmiä, kuten amino-, fosfaatti- ja metyyliryhmiä.
- Sidosspesifisyys – entsyymi toimii tietyntyyppiseen kemialliseen sidokseen riippumatta molekyylin muusta rakenteesta.
- Stereokemiallinen spesifisyys – entsyymi toimii tietyntyyppiseen steeriseen tai optiseen isomeeriin.
Vaikkakin entsyymit osoittavat suurta spesifisyyttä, kofaktorit voivat palvella monia apoentsyymejä. Esimerkiksi nikotiiniamidiadeniinidinukleotidi (NAD) on koentsyymi monissa dehydrogenaasireaktioissa, joissa se toimii vedyn akseptorina. Niitä ovat muun muassa alkoholidehydrogenaasi-, malaattidehydrogenaasi- ja laktaattidehydrogenaasireaktiot.