Immunohistokemia (IHC) on tehokas mikroskooppiin perustuva tekniikka, jolla voidaan visualisoida solukomponentteja, esimerkiksi proteiineja tai muita makromolekyylejä kudosnäytteistä. IHC:n vahvuus on intuitiivinen visuaalinen tuotos, joka paljastaa kohdeproteiinin olemassaolon ja lokalisoitumisen eri solutyyppien, biologisten tilojen ja/tai alisoluittaisen lokalisoitumisen yhteydessä monimutkaisissa kudoksissa.
IHC-tekniikka keksittiin 1940-luvulla (Coons, Creech, & Jones, & Jones, 1941), ja IHC-tekniikkaa käytetään rutiininomaisesti tärkeänä työvälineenä terveydenhoidossa ja patologian piirissä esimerkiksi diagnostiikassa tai potilaiden kerrostamiseksi optimoituja hoitomuotoja varten. IHC:tä käytetään laajalti myös tutkimuksessa, jossa analysoidaan kiinnostavia molekyylejä niiden roolin tutkimiseksi sekä terveissä että sairaissa soluissa ja kudoksissa molekyyli-, solu- tai kudostasolla. Kohteiden visualisointi kudoksissa IHC:n tai IHC-pohjaisten menetelmien avulla voidaan toteuttaa monin eri tavoin, ja eri sovelluksia ja määrityksiä varten on olemassa lukuisia protokollia. Vaikka IHC on yleensä vankka ja vakiintunut menetelmä, uudet määritykset vaativat usein huolellista optimointia kudoksesta tai kohdeproteiinin, sideaine-molekyylin ja/tai raportointijärjestelmän ominaisuuksista riippuen. Monien vuosien tekninen kehitys ja spesifisten sitoutuvien molekyylien saatavuuden valtava lisääntyminen ovat parantaneet huomattavasti IHC:n käyttökelpoisuutta ja sovellusalueita. IHC-pohjaisten tekniikoiden ja reagenssien kehitys on antanut tutkijoille ja terveydenhuollon tarjoajille entistä tarkempia välineitä, määrityksiä ja biomarkkereita. Lisäksi tekninen kehitys on mahdollistanut esimerkiksi useiden proteiinien erittäin herkän samanaikaisen havaitsemisen samasta näytteestä ja proteiini-proteiini-interaktioiden havaitsemisen (ks. Proximity Ligation Assay).
Klassinen IHC-määritys on esitetty kuvassa 1, ja siinä havaitaan kudosnäytteessä olevan yksittäisen proteiinikohteen ilmentämät epitoopit käyttämällä ”primaarista vasta-ainetta”, joka kykenee sitouttamaan kyseisiä epitooppeja suurella erityisyydellä. Epitopin ja vasta-aineen välisen sitoutumistapahtuman jälkeen lisätään ”sekundäärivasta-aine”, joka kykenee sitomaan primaarivasta-aineen erittäin spesifisesti. Toissijainen vasta-aine on kytketty reportterimolekyyliin, ja vasta-aine-vasta-aine-sitoutumistapahtuman jälkeen lisätään kemiallinen substraatti, joka reagoi reportterimolekyylin kanssa tuottaen värillisen saostuman koko epitooppi-vasta-aine-kompleksin kohdalle.
Kuva 1. Immunohistokemian perusperiaate.
Skeemallisessa kuvassa (kuva 1) formaliinikiinnitteinen parafiiniin upotettu kudosleike värjätään primaarivasta-aineella, joka on suunnattu tiettyä proteiinikohdetta vastaan. Ensisijaista vasta-ainetta sisältävä liuos lisätään kudosleikkeeseen, ja vasta-aineiden annetaan jonkin aikaa löytää kohteensa ja sitoutua siihen. Tämän vaiheen jälkeen sitoutumattomat ja ylimääräiset vasta-aineet pestään pois ja sekundäärinen vasta-aine lisätään. Sekundäärisen vasta-aineen, joka sisältää linkkerimolekyylin, jossa on piparjuuriperoksidaasientsyymiä (HRP), annetaan myös sitoutua primaariseen vasta-aineeseen jonkin aikaa, minkä jälkeen suoritetaan toinen pesuvaihe. Tämän jälkeen lisätään 3,3′ diaminobentsidiini (DAB). HRP-entsyymi muuttaa DAB-substraatin ruskehtavaksi saostumaksi, joka laskeutuu kudokseen reaktiokohtaan, jolloin saadaan visuaalinen esitys siitä, missä primaarivasta-aine ensimmäisen kerran sitoi kohteensa.
Tekniikka
Kudoksen valmistelu
Kudoksella on keskeinen rooli kokeessa, ja on tärkeää, että se on käsitelty siten, että epitooppeja ja asianmukaista morfologiaa on säilytetty. Yleisin käsittely IHC:tä varten on valmistaa formaliiniin kiinnitettyjä parafiiniin upotettuja (FFPE) kudosblokkeja. Formaliinifiksaation tarkoituksena on saada aikaan proteiinien kemiallinen ristisilloittuminen kudoksessa. Tämä lopettaa kaikki soluprosessit ja jäädyttää solukomponentit siihen paikkaan ja siihen muotoon, jossa ne olivat kiinnityshetkellä, ja estää myös hajoamisen. Riittävän fiksaation jälkeen kudos jatkokäsitellään ja lopulta upotetaan parafiinilohkoihin, jotka sitten leikataan ohuiksi viipaleiksi (yleensä 4-10 µm) mikrotomilla. Leikkeet siirretään lasilevyille ja niiden annetaan kiinnittyä ennen jatkokäsittelyä.
Joskus käytetään muitakin kiinnitysmenetelmiä kuin formaliinia. Niitä ovat muunlaiset aldehydit tai erilaisten alkoholiliuosten käyttö. Paras fiksatiivin valinta riippuu hyvin paljon tutkimuskohteesta. Yleinen vaihtoehto FFPE:lle on pakastettujen kudosnäytteiden valmistaminen. Tällöin kudos upotetaan kryosuojakalvoon ja pakastetaan, ja fiksaatio suoritetaan leikkauksen jälkeen. Pakastetut kudokset leikataan kryostaateissa, ja niiden etuna on lyhyt käsittelyaika ja herkkien epitooppien parempi säilyminen, mutta ne voivat usein olla histologisen morfologian säilymisen kannalta huonompia kuin FFPE-kudokset.
Antigeenin (epitoopin) talteenotto
Ristisilloittaviin fiksatiiveihin, kuten formaliiniin, tai fiksatiivisessa väliaineessa viettämäänsä liian pitkään aikaan liittyy huolenaiheena epitooppien naamioituminen, joka voi estää primaarista vasta-ainetta sitoutumasta kohteeseensa. Erityisesti FFPE-näytteiden kohdalla on usein tarpeen palauttaa osa kemiallisesta ristisilloituksesta ja ”hakea” epitoopit takaisin ennen varsinaista IHC-tutkimusta. Käytettävissä on useita antigeenin talteenottoprotokollia, ja tärkeimpiin strategioihin kuuluu kudoslautasen käsitteleminen lämmöllä, ruoansulatusentsyymeillä, pesuaineilla tai niiden yhdistelmillä. Yleisin menetelmä antigeenin talteenottoon FFPE-näytteissä on keittää kudoslevyjä paineella happamassa sitraattipuskurissa noin 15-20 minuuttia.
Vasta-aineen sitoutuminen
Sitovan molekyylin laatu ja spesifisyys ovat ratkaisevassa asemassa kaikissa IHC:hen perustuvissa tekniikoissa, ja sideaineen valinnalla voi olla suora vaikutus analyysin lopputulokseen, luotettavuuteen ja mahdollisesti myös tulkintaan. Vasta-aineet ovat ylivoimaisesti yleisin IHC:ssä käytetty sitoutumismolekyylityyppi, ja vaikka useimmat vasta-aineet pystyvät havaitsemaan riittävän hyvin oikean kiinnostuksen kohteena olevan molekyylin, niiden spesifisyys aiottuun kohteeseensa nähden voi myös vaihdella suuresti. Vasta-aineet, joilla on korkea spesifisyys, ovat sen vuoksi luotettavampia tulkittaessa ”kohdekohtaista” sitoutumista, koska ne tuottavat vain vähän tai ei lainkaan ”kohteen ulkopuolista” sitoutumista tai ”taustaa”. Vasta-aineet, jotka eivät ole yhtä spesifisiä, voivat tuottaa enemmän kohteen ulkopuolista sitoutumista, ja tästä johtuva tausta häiritsee mahdollisesti todellisten kohdesignaalien oikeaa tulkintaa. Vasta-aineita on kahta päätyyppiä: polyklonaalisia vasta-aineita, jotka ovat heterogeeninen sekoitus vasta-aineita, jotka sitovat kohteen eri epitooppeja, ja monoklonaalisia vasta-aineita, jotka kaikki sitovat samaa epitooppia. Polyklonaaliset vasta-aineet ovat usein hyvin tehokkaita, koska ne pystyvät havaitsemaan ja sitomaan useita epitooppeja samassa kohteessa. Niiden sitomat epitoopit ovat kuitenkin usein huonosti määriteltyjä, ja useiden ja erilaisten epitooppispesifisyyksien myötä kohteen ulkopuolisten sitoutumistapahtumien ja taustakohinan todennäköisyys kasvaa. Polyklonaalisten vasta-aineiden teho voi kuitenkin olla eduksi, koska sitoutumistapahtumien konsentraatio kohdemolekyylin ympärillä on yleensä suurempi kuin mahdollinen taustakohina. Haittapuolena on, että polyklonaaliset vasta-aineet ovat yleensä rajallisia resursseja, koska ne ovat peräisin eläinten seerumista. Monoklonaalisilla vasta-aineilla on sitä vastoin enemmän jatkuvuutta, koska niitä voidaan tuottaa hybridoomasolulinjoissa. Monoklonaaliset vasta-aineet ovat myös usein hyvin määriteltyjä epitoopin sitoutumisen suhteen, mutta ne voivat silti tuottaa vaikeasti tulkittavia tuloksia, jos spesifisyys on heikko tai jos kohde-epitooppia esiintyy vähän.
Vasta-aineen konsentraation huolellinen optimointi ja titraus kutakin määritystä varten on tarpeen, koska tulos ei riipu ainoastaan vasta-aineen spesifisyydestä ja affiniteetista kohdetta kohtaan, vaan myös näytteessä olevien kohdepitooppien ja mahdollisten kohdepitooppien ulkopuolisten epitooppien konsentraatiosta ja saatavuudesta. Jos näytteeseen lisätään liikaa vasta-aineita, mahdollisten matala-affiniteettisten kohteen ulkopuolisten sitoutumistapahtumien määrä kasvaa, kun kohteen epitooppi(t) on kyllästetty sitoutujilla. Kun vasta-ainekonsentraatiota lasketaan, kohteen ulkopuoliset sitoutumistapahtumat ovat harvinaisempia, koska niiden affiniteetti on yleensä alhaisempi kuin kohteen sisäisten sitoutumistapahtumien. Kun taustaa yritetään vähentää käyttämällä matala-affiniteettista vasta-ainetta, riskinä on, että kohdesignaalit heikkenevät samalla niin paljon, että saadaan väärä negatiivinen tulos.
Muuntyyppisiä IHC-pohjaisissa tekniikoissa toisinaan käytettäviä sitojamolekyylejä ovat affibodyt, peptidit, vasta-ainefragmentit tai muut pienet molekyylit.
Havaitsemisjärjestelmät
Koko IHC:n suorittamisen tarkoituksena on saada visuaalinen esitys siitä, missä kohdekohde esiintyy koekudoksessa, ja mieluiten myös saada tietoa kohdekohteen ilmentymismallista heterogeenisten solupopulaatioiden ja/tai alisoluittaisten lokalisaatioiden keskuudessa. Tästä on esimerkki kuvassa 2, jossa havainnollistetaan, miten eri vasta-aineita käytetään eri solu- tai kudoskompartmenttien visualisointiin monimutkaisessa kudoksessa. Kohteen ja vasta-aineen vuorovaikutuksen visualisoimiseksi tarvitaan jonkinlainen havaitsemisjärjestelmä, joka tuottaa havaittavan värjäyksen tai signaalin. Yleisin tapa tuoda havaitsemisjärjestelmä kokeeseen on käyttää sekundääristä vasta-ainetta, joka kantaa ennalta sitoutunutta reportterimolekyyliä eli entsyymiä tai fluoroforia. Toissijaiset vasta-aineet on yleensä kohdistettu erityisesti eri eläinlajin vasta-ainemolekyyleihin. Jos esimerkiksi primaarivasta-aine on kasvatettu kanissa, sekundaarivasta-aine on kasvatettava toisessa eläimessä ja kohdistettava erityisesti kanin vasta-aineisiin.
| Esofagus | Suurennos | ||||
|---|---|---|---|---|---|
| Hematoksyliinivärjäys | Ei vasta-ainevärjäystä | ||||
| TP63 CAB000083 |
Nukleaarinen värjäys | ||||
| EGFR CAB000035 |
Kalvojen värjäytyminen | ||||
| G6PD HPA000247 |
HPA000247 | Sytoplasminen värjäytyminen | |||
| LAMB2 (laminiini) CAB000053 |
Kudoksen sidekudos |
Kuvio2. Eri proteiinikohteiden visualisointi monimutkaisissa kudoksissa. Oikeanpuoleisessa sarakkeessa on vasemmanpuoleisen sarakkeen vastaavien kuvien suurennos.
IHC-kuvassa (kuva 2) neljällä eri vasta-aineella värjätyt peräkkäiset leikkaukset ihmisen ruokatorvesta mahdollistavat erilaisten proteiinien ilmentymismallien suoran vertailun kudoksessa ja alisoluisissa lokeroissa. Ylimmissä kuvissa on vertailun vuoksi vain hematoksyliinin vastavärjäys. P63-vasta-aine värjää solujen tumia solupopulaatiossa, joka sijaitsee ruokatorven epiteelin tyviosassa. EGFR (epidermaalisen kasvutekijän reseptori) -vasta-aine näyttää värjäävän samaa solupopulaatiota kuin p63, mutta värjää solukalvoja tuman sijaan. G6PD (glukoosi-6-fosfaattidehydrogenaasi) -vasta-aine värjää laajemman valikoiman ruokatorven epiteelisolujen ja myös sidekudoksessa sijaitsevien solujen sytoplasmaa. Laminiini (LAMB2) -vasta-aine värjää ainoastaan ruokatorven alla olevan sidekudoksen soluja ja rakenteita.
FFPE-kudosnäytteiden kohdalla yleisin osoitusmenetelmä on käyttää entsymaattisia reaktioita, joiden avulla vasta-aineen sitoutumiskohtaan muodostuu värillinen saostuma. Sekundääriset vasta-aineet kantavat tällöin entsyymiä, esim. piparjuuriperoksidaasia (HRP) tai emäksistä fosfataasia (AP), jotka kykenevät muuttamaan kromogeenejä, kuten 3,3′ diaminobentsidiiniä (DAB) tai 5-bromi-4-kloori-3-indolyylifosfaatti/p-nitroblauetetratsoliumkloridia (BCIP/NBT) ruskeiksi tai sinertäviksi saostumiksi, jotka laskeutuvat kudokseen reaktiokohtaan. Kromogeeniset värjäykset ovat havaittavissa valomikroskopiassa, ja ne ovat yleensä hyvin stabiileja pitkiä aikoja, mikä on eduksi, jos koe on arkistoitava tai sitä on tarkasteltava myöhemmin.
Jäädytetyissä kudosleikkeissä on tavallisempaa käyttää fluorofooriin sidottuja sekundäärivasta-aineita, jotka emittoivat tiettyä väriä (tavallisesti vihreää, punaista tai sinistä), kun ne herätetään oikeilla valon aallonpituuksilla. Lisäksi fluoroforit eivät yleensä ole stabiileja pitkiä aikoja. Fluorofoorien käytön etuna on kuitenkin se, että ne tarjoavat helpon menetelmän kaksoisleimauskokeiden suorittamiseen, kun samasta näytteestä tutkitaan useita vasta-aineita useita kohteita vastaan. Sekundääriset vasta-aineet on kohdistettava eri primaarisiin vasta-aineisiin ja ne on myös kytkettävä eri fluorofooreihin. Eri sekundääriset vasta-aineet havaitaan sitten erikseen stimuloimalla niitä peräkkäin eri valon aallonpituuksilla. Nämä erilaiset herätystulokset tallennetaan erillisinä kuvina (tai värikanavina), ja ne voidaan myöhemmin asettaa päällekkäin, jotta voidaan päätellä proteiinien yhteislokalisaatioita jne.
Reportaattoreita kantavien sekundääristen vasta-aineiden käyttäminen havaitsemiseen on jo itsessään vahvistusvaihe, koska useat sekundääriset vasta-aineet kykenevät sitoutumaan yhteen primaariseen vasta-aineeseen, mutta toisinaan halutaan lisävahvistusvaiheita kokeilun signaalin ja herkkyyden lisäämiseksi. Tällaisissa tapauksissa sekundäärivasta-aine voi sen sijaan kantaa ”linkkerimolekyylejä”, esimerkiksi biotiinipolymeerejä, jotka pystyvät rekrytoimaan suuremman määrän reportterimolekyylejä myöhemmissä vaiheissa. Tämä signaalien vahvistamisstrategia on käyttökelpoinen sekä entsymaattisissa että fluoresoivissa detektiomenetelmissä.
Vastavärjäys
Kromogeenejä käyttävässä immunohistokemiallisessa värjäyksessä on usein hyötyä siitä, että siihen käytetään vastavärjäystä, joka parantaa kontrastia ja helpottaa histologisten piirteiden havaitsemista. Yleisin FFPE-näytteissä käytetty vastavärjäys on hematoksyliini, joka värjää solujen sytoplasman vaalean sinertävällä värillä ja värjää solujen ytimet tummemmalla sinertävällä vivahteella. Fluoresoivia värjäyksiä ei yleensä vastavärjätä hematoksyliinillä, koska havaitsemismenetelmä ei perustu valomikroskopiaan. Sen sijaan tavallisin tapa saada vastavärjäys fluoresenssille on merkitä solujen tumat lisäämällä nukleiinihappoja sitovia fluoresoivia väriaineita. Varsinaisen immunohistokemiallisen reaktion jälkeen ainoat jäljellä olevat vaiheet ovat näytteen peittäminen ja sulkeminen suojausta ja pitkäaikaista säilytystä varten. Yleisin tapa on ”liimata” kansilevy näytteeseen kaupallisesti saatavilla olevilla tarkoitukseen valmistetuilla hartseilla.
Konkreettisia esimerkkejä
IHC:tä käytetään laajalti sekä tutkimuksessa että kliinisessä käytännössä. Human Protein Atlas (HPA) -hanke on erinomainen esimerkki siitä, miten korkean läpimenon IHC:tä käytetään ihmisen proteomin laajamittaiseen kartoittamiseen monissa kudoksissa, syövissä ja soluissa. HPA-hankkeessa virtaviivainen sisäinen suuren mittakaavan vasta-ainetuotantoketju helpottaa spesifisten vasta-aineiden tuottamista, ja kun ne ovat läpäisseet perusluonnehdinta- ja validointijärjestelyt, niitä käytetään satoja kudosydämiä sisältävien kudosmikrosarjojen systemaattiseen värjäykseen yhden kokeen aikana. HPA:n käyttämä IHC-järjestelmä perustuu pitkälti protokollien standardointiin ja koneiden avulla tapahtuvaan automatisointiin, mutta optimaalisen titrauksen arviointi kullekin vasta-aineelle suoritetaan manuaalisesti ennen kuin vasta-aine hyväksytään värjättäväksi koko kudosjoukkoon. Kukin värjätty kudosydän kommentoidaan kudosten ja solutyyppien immunohistokemiallisen värjäytymisen osalta, minkä jälkeen se julkaistaan korkearesoluutioisena kuvana verkkoportaalissa kaikkien vapaasti tarkasteltavaksi.
Kliinisessä käytännössä IHC:tä käytetään pääasiassa patologiassa auttamaan lääkäreitä arvioimaan kudosnäytteitä terveiden ja sairaiden tilojen suhteen, asettamaan diagnooseja ja määrittelemään erityyppisten syöpien molekulaarisia alatyyppejä. Erityinen esimerkki IHC:n diagnostisesta käytöstä on, kun patologit saavat metastaattisen kasvainnäytteen ja primaarikasvaimen kudosalkuperä on tuntematon. Näissä tapauksissa patologit käyttävät paneelia erilaisia vasta-aineita, jotka kohdistuvat kudosspesifisiin proteiineihin, kuten eturauhasspesifiseen antigeeniin eturauhassyövässä tai estrogeenireseptoriin gynekologisissa syövissä tai sytokeratiini 20:een ruoansulatuskanavan syövissä (Gremel ym., 2014). Kun laaja luokittelu on tehty, käytetään lisää kudospesifisiä vasta-aineita primaarikasvaimen alkuperän tarkempaan määrittämiseen. Tästä tiedosta on hyötyä valittaessa parasta tai sopivinta strategiaa lääkehoitoa varten ja/tai primaarikasvaimen paikallistamiseksi sädehoitoa ja/tai leikkausta varten.
Viitteet ja linkit
Yleisesti käytetyt vasta-aineet syövän diagnostiikassa:
Gremel G et al., A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Histopathology. (2014)
PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255
Katsaus vasta-aineiden validointiin IHC:
O’Hurley G et al., Garbage in, garbage out: kriittinen arviointi immunohistokemiallisten biomarkkereiden validointiin käytettävistä strategioista. Mol Oncol. (2014)
PubMed: 24725481 DOI: 10.1016/j.molonc.2014.03.008
Antibodypedia – Avoin tietokanta julkisesti saatavilla olevista vasta-aineista ja niiden käyttökelpoisuudesta eri sovelluksissa:
IHC-maailma – Protokollia, foorumi, tuotteita ja paljon muuta:
YouTube-klippi, joka havainnollistaa IHC:tä BioGenexLaboratoriesilta: