00:00:07.25Hei, nimeni on Jennifer Doudna UC Berkeleystä
00:00:09.26ja olen täällä tänään kertomassa siitä, miten paljastimme
00:00:12.26uusi genomitekniikka.
00:00:15.07Tämä tarina alkaa bakteerien immuunijärjestelmästä
00:00:20.12joka tarkoittaa sen ymmärtämistä, miten bakteerit
00:00:22.14taistelevat virusinfektiota.
00:00:24.26On käynyt ilmi, että monet bakteerit
00:00:28.04on kromosomissaan,
00:00:30.09jota katsotte tässä
00:00:32.15näissä mustissa timanteissa
00:00:36.18näytetty toistosekvenssi, jonka välissä on sekvenssejä
00:00:40.19. jotka ovat peräisin viruksista
00:00:43.08ja nämä ovat huomanneet mikrobiologit
00:00:46.20, jotka sekvensoivat bakteerien genomeja, mutta kukaan ei tiennyt
00:00:50.10mitä näiden sekvenssien funktio voisi olla
00:00:53.06kunnes huomattiin, että niillä on tapana esiintyä myös
00:00:58.09erien geenien kanssa, jotka usein koodaavat proteiineja
00:01:03.29jotka ovat homologisia entsyymeille, jotka tekevät mielenkiintoisia asioita
00:01:09.03jotka tekevät esimerkiksi DNA:n korjausta.
00:01:10.12Siten oli hypoteesi, että tämä järjestelmä
00:01:14.04 jota alettiin kutsua CRISPR
00:01:16.08, joka on lyhenne tämäntyyppiselle toistuvalle lokukselle
00:01:19.14että nämä CRISPR-järjestelmät voisivat itse asiassa olla
00:01:22.29bakteerien hankittu immuunijärjestelmä
00:01:26.00joka voisi mahdollistaa sekvenssien integroimisen
00:01:29.06viruksista ja sitten jotenkin käyttää niitä myöhemmin
00:01:32.07suojellakseen solua infektiolta
00:01:35.26 samasta viruksesta.
00:01:37.05Tämä oli siis mielenkiintoinen hypoteesi
00:01:39.11ja ryhdyimme tutkimaan tätä
00:01:41.182000-luvun puolivälissä heti julkaisun jälkeen
00:01:44.15kolmen artikkelin julkaisemisen jälkeen, jotka osoittivat
00:01:47.13virussekvenssien sisällyttämisen
00:01:50.00 näihin genomilokeroihin.
00:01:52.07Ja niinpä seuraavien vuosien aikana kävi ilmi
00:01:55.17että nämä CRISPR-järjestelmät
00:01:58.08ovat todella bakteerien hankittuja immuunijärjestelmiä
00:02:01.18Siten tähän asti kukaan ei tiennyt, että bakteereilla
00:02:04.24voisi itse asiassa olla keino sopeutua
00:02:08.08viruksiin, jotka pääsevät soluun
00:02:10.29mutta tämä on yksi tapa, jolla he tekevät sen
00:02:12.14ja siihen kuuluu vieraan DNA:n havaitseminen
00:02:15.17joka ruiskutetaan kuten tässä esimerkissä
00:02:18.04viruksesta, joka pääsee soluun
00:02:20.07 CRISPR-järjestelmä mahdollistaa lyhyiden viruksen DNA-molekyylien lyhyiden pätkien integroitumisen
00:02:29.15 CRISPR-paikannukseen
00:02:31.07ja sitten toisessa vaiheessa
00:02:33.27, joka näkyy tässä CRISPR RNA:n biogeneesinä
00:02:38.20. Nämä CRISPR-sekvenssit itse asiassa transkriboituvat
00:02:42.20solussa RNA:n palasiksi
00:02:45.15, joita käytetään myöhemmin yhdessä
00:02:48.23 CAS-geenien koodaamien proteiinien kanssa
00:02:52.09 nämä CRISPR-assosioituneet geenit
00:02:54.01muodostaakseen häiritseviä tai interferenssikomplekseja
00:02:58.12, jotka voivat käyttää näiden RNA-molekyylien muodossa olevaa tietoa
00:03:01.17 muodostaakseen emäspareja
00:03:04.08viruksen DNA:ssa olevien vastaavien sekvenssien kanssa.
00:03:07.18Se on siis erittäin näppärä tapa, jonka bakteerit
00:03:10.12ovat keksineet ottaa hyökkääjänsä
00:03:13.06ja kääntää sekvenssi-informaatio niitä vastaan.
00:03:17.00Siten omassa laboratoriossani
00:03:20.21on ollut hyvin kiinnostunut jo pitkään
00:03:23.09on ymmärtänyt, miten RNA-molekyylejä
00:03:26.03käytetään auttamaan soluja selvittämään
00:03:32.00miten säädellä proteiinien ilmentymistä
00:03:34.03genomista.
00:03:35.05Ja niinpä tämä vaikutti myös erittäin mielenkiintoiselta
00:03:37.27esimerkiltä tästä, ja
00:03:39.18aloimme tutkia molekulaarisia perusmekanismeja
00:03:42.24millä tämä reitti toimii.
00:03:45.01Ja vuonna 2011 menin tieteelliseen konferenssiin
00:03:49.23ja tapasin kollegani,
00:03:52.13Emmanuelle Charpentierin, joka näkyy tässä kuvassa
00:03:56.10kaukana vasemmalla ja Emmanuellen laboratoriossa
00:03:58.14 työskentelee mikrobiologian ongelmien parissa ja he ovat
00:04:02.11erityisesti kiinnostuneita bakteereista
00:04:04.00jotka ovat ihmisen patogeenejä.
00:04:06.01Hän tutki organismia nimeltä
00:04:08.03Streptococcus pyogenes, joka on bakteeri
00:04:11.15joka voi aiheuttaa hyvin vakavia infektioita ihmiselle
00:04:14.25ja mikä tässä bakteerissa oli uteliasta oli se, että
00:04:16.25 sillä
on CRISPR-järjestelmä ja tässä organismissa
00:04:19.06oli yksi geeni, joka koodasi proteiinia, joka tunnetaan nimellä Cas9, jonka oli geneettisesti osoitettu olevan välttämätön CRISPR-järjestelmän toiminnalle Streptococcus pyogenesissa,
00:04:26.09>00:04:28.16.23mutta kukaan ei tiennyt tuolloin, mikä tuon proteiinin funktio
00:04:33.05on.
00:04:34.20Ja niinpä kokoonnuimme yhteen ja rekrytoimme
00:04:37.20ihmisiä omista tutkimuslaboratorioistamme
00:04:40.26aloittaaksemme testaamaan Cas9:n funktiota.
00:04:43.17Projektin avainhenkilöt
00:04:45.20näyttävät tässä kuvassa
00:04:48.00Keskellä on Martin Jinek
00:04:50.03joka on postdoc omassa laboratoriossani
00:04:52.17ja hänen vieressään sinisessä paidassa
00:04:54.22on Kryztof Chylinski, joka oli opiskelija
00:04:57.20Emmanuellen laboratoriossa
00:04:58.26ja niinpä nämä kaksi kaveria yhdessä
00:05:00.21Ines Fonfaran kanssa, joka on äärioikealla,
00:05:02.10joka on postdoc Emmanuellen kanssa
00:05:04.01alkoivat tehdä kokeita Atlantin yli
00:05:07.25ja jakaa tietojaan.
00:05:10.09Ja he saivat selville, että
00:05:13.06Cas9 on itse asiassa kiehtova proteiini
00:05:16.04jolla on kyky olla vuorovaikutuksessa DNA:n kanssa
00:05:19.28ja synnyttää kaksisäikeisen katkoksen
00:05:22.02DNA:ssa sekvensseissä, jotka vastaavat
00:05:25.06ohjaus-RNA:n sekvenssiä
00:05:27.08ja tässä diassa näette, että opas-RNA:n oranssilla merkitty sekvenssi, joka on emäspareissa kaksoiskierteisen DNA:n yhden säikeen kanssa
00:05:34.18.11ja mikä tärkeintä, tämä RNA
00:05:39.28vuorovaikuttaa toisen RNA-molekyylin
00:05:42.09nimisen tracr-molekyylin kanssa, joka muodostaa rakenteen
00:05:46.03joka rekrytoi Cas9-proteiinin
00:05:47.29siten nämä kaksi RNA:ta ja yksi proteiini
00:05:50.13 luonnossa ovat ne, joita tarvitaan
00:05:52.23 jotta tämä proteiini tunnistaa
00:05:56.05mitä normaalisti olisi viruksen DNA:ta
00:05:58.11solussa ja proteiini
00:06:01.13kykenee pilkkomaan nämä,
00:06:02.14 kirjaimellisesti hajottamalla kaksoiskierteisen DNA:n.
00:06:05.24Ja kun tajusimme tämän
00:06:08.14ajattelimme: eikö olisi mahtavaa
00:06:10.26jos voisimme itse asiassa luoda yksinkertaisemman järjestelmän
00:06:13.29 kuin luonto on tehnyt
00:06:15.02liittämällä yhteen nämä kaksi RNA-molekyyliä
00:06:18.04luodaksemme systeemin, joka koostuisi yhdestä proteiinista
00:06:20.16ja yhdestä ohjaavasta RNA:sta.
00:06:22.28Ajatuksena oli siis periaatteessa ottaa
00:06:25.17nämä kaksi RNA:ta, jotka näet dian toisella puolella
00:06:29.29ja sitten periaatteessa yhdistää ne toisiinsa
00:06:33.19luodaksemme niin sanotun
00:06:35.04yhden ohjaavan RNA:n.
00:06:36.22Laboratoriossa Martin Jinek
00:06:38.25teki tuon rakenteen
00:06:40.21ja teimme hyvin yksinkertaisen kokeen
00:06:44.22testataksemme, oliko meillä todella
00:06:46.18ohjelmoitava DNA:ta pilkkova entsyymi
00:06:49.29ja ideana oli luoda lyhyitä yksittäisiä ohjaavia RNA:ita, jotka tunnistavat eri kohtia pyöreässä DNA-molekyylissä, jonka näet tässä, ja ohjaavat RNA:t suunniteltiin, ja ne oli suunniteltu, ja ne olivat
00:07:03.10 tunnistamaan ne sekvenssit, jotka näkyvät punaisilla viivoilla
00:07:06.17 diaesityksessä, ja koe oli sitten
00:07:10.16 ottaa tuo plasmidi, tuo pyöreä DNA-molekyyli
00:07:13.21ja inkuboida sitä kahdella eri restriktioentsyymillä (tai leikkaavalla) entsyymillä,
00:07:18.27Yhtä kutsutaan SalI:ksi, joka leikkaa
00:07:21.23DNA:ta tavallaan ylävirtaan päin kaukana päässä
00:07:25.05DNA:sta tässä kuvassa
00:07:26.12harmaassa laatikossa,
00:07:27.19ja toista kohdetta, joka on suunnattu
00:07:31.00RNA-ohjatulla Cas9:llä
00:07:33.13näissä punaisella esitetyissä eri kohdissa.
00:07:35.16Ja hyvin yksinkertaisessa kokeessa
00:07:37.19tehdimme tämän inkubaatioreaktion
00:07:39.26plasmidi-DNA:n kanssa ja tämä on tulos
00:07:43.24ja tätä siis katsotte
00:07:45.28on agaroosigeeli
00:07:47.29joka antaa meille mahdollisuuden erottaa
00:07:49.16halkaistut DNA-molekyylit
00:07:51.20ja voitte nähdä, että jokaisella näistä reaktiokaistoista
00:07:54.22saamme erikokoisen DNA-molekyylin, joka vapautuu
00:07:58.12tämästä kahdesti pilkotusta plasmidista
00:08:00.16jossa DNA:n koko
00:08:03.29vastaa pilkkoutumista eri kohdissa
00:08:06.11joita nämä opas-RNA-sekvenssit
00:08:08.26ohjaavat, jotka on merkitty punaisella
00:08:10.24siten tämä oli todella jännittävä hetki
00:08:12.29seuraavasti hyvin yksinkertainen koe, joka oli
00:08:15.15 eräänlainen ”A ha!”-hetki
00:08:17.03 kun sanoimme, että meillä on todella ohjelmoitava DNA:n leikkausentsyymi
00:08:22.02ja että voimme ohjelmoida sen lyhyellä RNA:n pätkällä
00:08:24.15 pilkkomaan periaatteessa minkä tahansa kaksoissäikeisen DNA-sekvenssin
00:08:28.07Syy, miksi olimme niin innostuneita
00:08:30.23entsyymistä, joka voidaan ohjelmoida
00:08:33.19 tuottamaan kaksisäikeisen DNA:n murtumia
00:08:36.01 missä tahansa sekvenssissä, on se, että
00:08:39.00Tiedeyhteisössä oli pitkään ollut kokeita
00:08:42.16 jotka osoittivat
00:08:45.13että soluilla on tapoja korjata kaksisäikeisiä DNA-katkoksia
00:08:49.26jotka johtavat muutoksiin
00:08:52.02 DNA:n genomitiedoissa
00:08:55.21siten tässä diassa näytetään, että
00:08:58.20kaksoisjuosteisen katkoksen syntymisen jälkeen
00:09:01.14millä tahansa entsyymillä, jotka voivat tehdä tämän
00:09:04.13 mukaan lukien Cas9-järjestelmä
00:09:06.05kaksijuosteiset katkokset solussa
00:09:09.07havaitaan ja korjataan kahdenlaisilla reiteillä
00:09:13.15yksi vasemmalla oleva, joka sisältää
00:09:17.26ei-homologisen päätyliitoksen
00:09:20.07 jossa DNA:n päät liimataan kemiallisesti
00:09:24.07 takaisin yhteen yleensä siten, että katkoskohdassa
00:09:26.18on pieni insertio tai deletio
00:09:28.25kohdassa
00:09:29.27ja oikealla puolella
00:09:32.01on toinen tapa, jolla korjaus tapahtuu
00:09:34.00homologian suunnatun korjauksen
00:09:37.22välityksellä, jossa luovuttaja-DNA-molekyyli
00:09:39.14jossa on sekvenssejä, jotka vastaavat niitä
00:09:43.28kaksisäikeisen katkoksen paikkaa reunustavia sekvenssejä, voidaan integroida
00:09:48.05genomiin katkoskohtaan
00:09:50.10kaksisäikeisen katkoksen kohdalle uuden geneettisen informaation
00:09:54.06sisällyttämiseksi genomiin
00:09:55.15Siten tämä oli antanut monille tutkijoille
00:09:59.04ajatuksen siitä, että jos olisi olemassa työkalu
00:10:01.04tai teknologia, joka sallisi
00:10:03.05tieteilijöiden tai tutkijoiden tuoda
00:10:06.12kaksisäikeisiä katkoksia kohdennetuille kohdille
00:10:09.00solun DNA:ssa, niin yhdessä
00:10:12.12kaikkien nyt saatavilla olevien genomin sekvensointitietojen
00:10:14.21 kanssa tiedämme
00:10:16.10solun koko geneettisen sekvenssin
00:10:18.21ja jos tietäisimme, missä mutaatio on tapahtunut, joka aiheuttaa esimerkiksi sairauden, voisimme itse asiassa käyttää tällaista teknologiaa tuomaan DNA:ta, joka korjaisi mutaation,
00:10:26.25.00tai synnyttää mutaation
00:10:32.23 jota haluaisit tutkia tutkimusympäristössä
00:10:35.04Siten tämän teknologian voima on
00:10:38.28todellisuudessa ajatus siitä, että voimme nyt synnyttää
00:10:41.20 tällaisia kaksoissidekatkoksia
00:10:43.17 tiedemiehinä valitsemissamme paikoissa
00:10:46.17ohjelmoimalla Cas9:n ja antamalla sitten
00:10:48.13solun tehdä korjauksia, jotka aiheuttavat
00:10:51.04genomisia muutoksia näiden katkosten paikoissa
00:10:54.15Mutta haasteena oli se, miten nämä katkokset ylipäätään tuotetaan, ja niinpä eri laboratorioissa oli kehitetty useita erilaisia strategioita tämän toteuttamiseksi.15Pääosin niistä, ja näytän tässä
00:11:08.21kaksi konkreettista esimerkkiä
00:11:10.17yksi kutsutaan sinkkisormi-nukleaaseja
00:11:12.25ja toinen TAL-efektidomeeneja
00:11:15.02Nämä molemmat ovat ohjelmoitavia tapoja
00:11:18.08luoda kaksisäikeisiä katkoksia DNA:ssa
00:11:20.21jotka perustuvat proteiinipohjaiseen DNA-sekvenssien tunnistamiseen
00:11:23.29, joten nämä ovat proteiineja
00:11:26.06jotka ovat modulaarisia, ja niitä voidaan luoda
00:11:29.12 erilaisina moduulien yhdistelminä
00:11:31.22 tunnistamaan erilaisia DNA-sekvenssejä
00:11:34.03se toimii teknologiana
00:11:37.18mutta se vaatii paljon proteiinien suunnittelua
00:11:40.24 tehdäkseen sen, ja mikä on todella jännittävää
00:11:43.16 tässä CRISPR/Cas9-entsyymissä
00:11:46.11on se, että se on RNA-ohjelmoitu proteiini
00:11:49.25siten yhtä ainoaa proteiinia voidaan käyttää
00:11:52.09jokaiseen DNA-kohtaan, jossa haluaisimme luoda katkoksen
00:11:54.27.13 yksinkertaisesti muuttamalla Cas9:ään liittyvän ohjaavan RNA:n sekvenssiä
00:12:00.24Siten sen sijaan, että luottaisimme proteiinipohjaiseen DNA:n tunnistamiseen
00:12:03.06, luotamme DNA:n tunnistamiseen
00:12:06.04RNA:n avulla
00:12:08.26 kuten alhaalla näkyy, joten tämä tarkoittaa sitä, että tämä on vain järjestelmä, joka on tarpeeksi yksinkertainen käytettäväksi kenelle tahansa, jolla on molekyylibiologian peruskoulutus.05voi hyödyntää tätä järjestelmää
00:12:20.29 tehdäkseen genomitekniikkaa
00:12:22.20ja niinpä tämä on työkalu, joka todella
00:12:26.06 Mielestäni täyttää olennaisen
00:12:29.03ja aiemmin puuttuneen osan
00:12:30.24 siitä, mitä voisimme kutsua biologian IT-työkalupakiksi, johon kuuluu paitsi kyky sekvensoida DNA:ta ja tarkastella sen rakennetta, me tiedämme kaksoiskierteestä 1950-luvulta lähtien.00ja sitten viime vuosikymmeninä
00:12:44.18on ollut mahdollista käyttää entsyymejä
00:12:46.09 kuten restriktioentsyymejä
00:12:47.26ja polymeraasiketjureaktiota
00:12:49.09eristää ja monistaa tiettyjä segmenttejä
00:12:52.19 DNA:sta, ja nyt Cas9:n
00:12:55.10 avulla meillä on teknologia, joka mahdollistaa
00:12:57.15facile genomitekniikan
00:12:59.13joka on laboratorioiden käytettävissä kaikkialla maailmassa
00:13:03.07kokeita varten, joita he saattavat haluta tehdä
00:13:05.08ja tämä on siis yhteenveto teknologiasta
00:13:10.11kaksikomponenttisen järjestelmän
00:13:11.29Se perustuu RNA-DNA-emästen yhdistämiseen
00:13:14.16tunnistamiseen
00:13:15.21ja mikä on hyvin tärkeää, koska tapa
00:13:18.24 että tämä järjestelmä toimii, se
00:13:19.28on itse asiassa melko suoraviivaista
00:13:21.18 tehdä jotain, mitä kutsutaan multipleksoinniksi
00:13:24.20 mikä tarkoittaa, että voimme ohjelmoida Cas9
00:13:27.00 useilla erilaisilla opas-RNA:illa
00:13:28.23samassa solussa tuottamaan
00:13:30.19moninkertaisia katkoksia ja tekemään asioita
00:13:32.06 kuten leikkaamaan suuria kromosomin osia
00:13:35.01ja yksinkertaisesti poistamaan ne yhdessä kokeessa.
00:13:38.25Ja tämä on johtanut todelliseen räjähdysmäiseen
00:13:42.03biologian ja genetiikan alalla
00:13:45.19monet laboratoriot ympäri maailmaa
00:13:48.08ovat ottaneet tämän tekniikan käyttöön
00:13:49.25kaikenlaisia hyvin mielenkiintoisia
00:13:51.15ja luovia sovelluksia varten
00:13:53.13 ja tämä on dia
00:13:54.24joka on itse asiassa jo melkein vanhentunut
00:13:56.11mutta antaakseni teille käsityksen
00:13:57.14 siitä, miten ala
00:14:00.07on todella lähtenyt liikkeelle
00:14:01.08siten julkaisimme alkuperäisen työmme Cas9:stä
00:14:04.10 vuonna 2012, ja siihen asti
00:14:07.16 CRISPR-biologian alalla oli hyvin vähän tutkimusta
00:14:08.18 missään
00:14:11.12se oli hyvin pieni ala
00:14:12.19ja sitten voitte nähdä, että
00:14:13.27alkaen vuodesta 2013 ja laajentuen
00:14:16.09kunnes nyt on tapahtunut tämä
00:14:17.21ihmeellinen julkaisujen räjähdysmäinen kasvu
00:14:20.16laboratorioista, jotka käyttävät
00:14:22.09tätä genomitekniikkana
00:14:24.01Siten on ollut todella hyvin jännittävää minulle
00:14:26.25 perustutkijana nähdä, että se, mikä alkoi
00:14:29.22perustutkimushankkeena
00:14:31.12on muuttunut teknologiaksi, joka osoittautuu
00:14:34.08mahdollistavaksi kaikenlaisille
00:14:35.28jännittäviä kokeiluja
00:14:37.07ja halusin vain lopuksi jakaa
00:14:40.07 kanssanne muutamia asioita
00:14:42.17joita tehdään tämän teknologian avulla
00:14:44.17siten tietysti vasemmalla puolella
00:14:47.13paljon perusbiologiaa, jota voidaan tehdä nyt
00:14:50.02malliorganismien
00:14:53.03ja erilaisten solulinjojen
00:14:55.02tekniikan avulla, joita viljellään laboratoriossa
00:14:56.21solujen käyttäytymisen tutkimiseksi
00:14:58.13mutta myös bioteknologiassa pystytään
00:15:01.23tekemään kohdennettuja muutoksia kasveissa
00:15:05.15ja erilaisissa sienissä, jotka voisivat olla erittäin
00:15:07.11hyödyllisiä erilaisissa teollisissa sovelluksissa
00:15:09.29 ja sitten tietysti biolääketieteessä
00:15:12.14, jossa on paljon kiinnostusta mahdollisuuksiin
00:15:14.14 käyttää tätä teknologiaa välineenä
00:15:17.03 todella uusien hoitomuotojen
00:15:21.06 keksimiseksi ihmisten sairauksia varten, luulen, että se on jotain
00:15:23.09joka on hyvin jännittävää ja todella jotain
00:15:26.05joka on jo näköpiirissä
00:15:27.09ja sitten tämä dia vain todella osoittaa
00:15:30.20mihin uskon, että näemme tämän menevän
00:15:33.15 tulevaisuudessa paljon mielenkiintoisia
00:15:36.20ja luovia suuntia
00:15:39.03joita on tulossa eri laboratorioissa
00:15:41.02sekä akateemisissa tutkimuslaboratorioissa
00:15:43.19mutta myös enenevässä määrin kaupallisissa laboratorioissa
00:15:45.29jotka mahdollistavat tämän teknologian käytön kaikenlaisissa sovelluksissa, joista monia emme voineet edes kuvitella edes kaksi vuotta sitten.
00:15:54.10Se on siis hyvin jännittävää, ja haluan vain antaa tunnustusta loistavalle tiimille
00:15:16:01.10 ihmisistä, jotka ovat olleet mukana työskentelemässä
00:16:04.22projektin parissa kanssani, ja meillä on
00:16:06.07on ollut loistavaa taloudellista tukea eri ryhmiltä
00:16:11.00ja on ollut ilo
00:16:13.00jakaakseni tämän kanssanne, kiitos.