Erilaiset vaikutukset ihmisen keratinosyyttisolujen kalvojen läpäisevyyteen ja elinkelpoisuuteen hyvin matalan intensiteetin megaäänikentissä

HaCaT-soluilla tutkittiin hyvin matalan intensiteetin USA:lle altistumisen (Ispta välillä 7-16 mW/cm2, joka on reilusti alle kavitaatiokynnyksen (100 mW/cm2) 1 MHz:n taajuudella. Kokeet suoritettiin ESI:n kuvassa S1 hahmotellulla vastaavalla lääketieteellisellä laitteistolla vaihtelevilla hoitoparametreilla, kuten Ispta, työvuorosykli ja sonikaatioaika. Alustavat kokeet osoittivat, että tässä tutkimuksessa käytetyllä altistusparametrien alueella lämpötila pysyi vakiona (1 °C:n sisällä) lukuun ottamatta US-energian lämpöhäviötä. Käsittelyt eivät myöskään osoittaneet tutkittujen vaikutusten merkittävää riippuvuutta US-aallon työjaksosta. Nämä havainnot ovat sopusoinnussa sen kanssa, että 1 MHz:n taajuudella USA:n absorptio on vähäistä; päinvastoin lämpövaikutukset ja työjakso voivat vaikuttaa soluihin ja kudoksiin, jotka on altistettu korkeammille taajuuksille, koska USA:n vaimennuskerroin on verrannollinen taajuuteen23,31.

Tulokset esitellään aluksi tarkastelemalla kahta olennaista altistumisparametria, sonikaatioaikaa ja Ispta:ta, erikseen. Solukalvon rakenteellisia ja fysikaalisia muutoksia (läpäisevyys, imeytymistehokkuus ja sisäistettyjen molekyylien maksimikoko) analysoidaan ja suhteutetaan vastaaviin sytotoksisiin vaurioihin ja mahdolliseen tulehduksen aktivoitumiseen. Tämän jälkeen tuloksia tulkitaan sonikaatioannoksen perusteella, joka määritellään Ispta:n ja altistusajan tulona eli näytteeseen sonikaation aikana kohdistuvan akustisen energian pintatiheytenä. Itse asiassa tutkittavat ilmiöt riippuvat tästä suureesta, ja tämän ansiosta pystyimme tunnistamaan altistusparametrien alueen, jossa esiintyy ohimenevää SP:tä vähäisin biologisin vaurioin.

Analyysi US-altistusajan vaikutuksesta

Matalan intensiteetin 1 MHz:n US-käytön aiheuttamia muutoksia HaCaT-solujen kalvon läpäisevyydessä arvioitiin vihreän fluoresoivan koettimen kalsekininin sisäänottotehokkuuden perusteella. Koska ehjät kalvot eivät läpäise kalseiinia, se on luotettava SP:n merkkiaine. Vihreäpositiivisten solujen prosenttiosuus kvantifioitiin virtaussytometria-analyyseillä 2.5 kohdan mukaisesti.

Kalvojen läpäisevyyden herkkyyden arvioimiseksi US-altistusajan suhteen käytettiin hyvin pientä US Ispta-arvoa. Huomattavaa on, että jo 7 ± 1 mW/cm2:n Ispta voi aiheuttaa merkittäviä vaikutuksia kalvojen läpäisevyyteen oikeilla altistusajoilla. Kuvassa 1 esitetään HaCaT- ja NIH-3T3-solujen rinnakkaisen virtaussytometriatutkimuksen edustavat tulokset (punaiset kolmiot ja siniset neliöt), kun molempia soluja sonikoitiin Ispta-arvolla ~7 mW/cm2 5′, 15′, 30′ ja 45′ ajan. Odotetusti solulinjojen vertailu matalien sonikointiaikojen jälkeen (alle sonoporaation kynnyksen) johtaa vähäiseen kalseiinin affiniteettiin, jolloin erojen (suurin HaCaT-soluissa) pitäisi selittää niiden kalvojen koostumus- ja läpäisevyysominaisuudet. Vielä tärkeämpää on, että molemmissa solulinjoissa imeytymistehokkuus kasvaa merkittävästi 15′:n altistuksesta alkaen, mikä vastaa sonikointiannosta (6,3 ± 0,9) J/cm2 , mikä viittaa SP-prosessin aktivoitumiseen. Kuvan 1 parhaiden sovitusten mukaan pidemmillä altistusajoilla kokeissamme on havaittavissa lineaarinen korrelaatio imeytymistehokkuuden ja altistusajan välillä, ja US:n aiheuttama imeytymisnopeus on identtinen sekä HaCaT- että NIH-3T3-soluissa (lineaarisen regression kaltevuus (%/min) 1,3 ± 0,2 HaCaT:lla 1,4 ± 0,2 ja NIH-3T3:lla 1,4 ± 0,2). Tämä merkitsisi sitä, että SP:n aiheuttama imeytymistehokkuuden kasvu on solulinjasta riippumaton ilmiö.

Sp-prosessin tarkemmaksi tutkimiseksi ja internalisaation luonnehtimiseksi käsiteltyjä HaCaT-soluja arvioitiin fluoresenssimikroskopialla. Virtaussytometriatulosten mukaisesti 5′:n ajan sonikoidut näytteet eivät osoita merkittävää muutosta kalvon läpäisevyydessä suhteessa kontrollinäytteeseen (käsittelemätön näyte), kun taas 15′:stä alkaen on havaittavissa lisääntyvä uptake-tehokkuus (kuten kuvassa 2 ja ESI:n kuvassa S2 on esitetty), vaikkakaan kaikki solut eivät osoittaneet fluoresenssia. Vastaavasti solut näyttävät vähemmän tiiviiltä ja tarttuvilta kuin kontrollinäytteessä, mikä viittaa tiukkojen yhteyksien löystymiseen. Kuvan 2 edustavat kuvat viittaavat kalseiinin heterogeeniseen lokalisaatioon solujen sisällä, ja itse asiassa konfokaalisella fluoresenssimikroskopialla voitiin selvästi erottaa HaCaT-solujen sisällä koettimen perifeerinen jakautuminen sisäisestä jakautumisesta (ks. kuva ja 3D-rekonstruktiot kuvassa 3). Yksityiskohtaisempia kuvia esitetään ESI:n kohdassa 3. Havainnot ovat johdonmukaisia fluorosondin kaksitasoisen imeytymisen kanssa: perifeerinen, jossa koetin on paikallistunut endoplasmisen retikulumin verkostoon plasmamembraanin ympärille; toinen, joka näkyi merkittävästi 30′:n altistumisen jälkeen ja jossa koettimen diffuusio sytoplasmaan aiheuttaa voimakasta fluoresenssia, joka on jakautunut tasaisesti koko soluun, myös nukleoplasmaan. On huomattava, että kalseiinin Stokesin halkaisija on ~1,36 nm, eivätkä diffuusioesteet estä sen kulkeutumista ydinsisäisesti29. Jaksoissa 3.2 ja 3.3 raportoidun täydellisemmän analyysin perusteella voidaan päätellä, että US-altistusannos ja koettimen molekyylipaino olivat hallitsevia tekijöitä, jotka määrittivät imeytymistä.

Punaiseen PI-fluorosondiin perustuvalla lisämäärityksellä arvioitiin sonikoitujen solujen natiivin kalvon läpäisevyyden palautumista (ks. myös kohta 2.3). PI:n sisäistyminen merkitsee sytotoksisten prosessien aktivoitumista. Vihreän ja punaisen väriaineen yhteislokalisaatio solujen sisällä osoittaa näin ollen kalvon palautumisprosessin epäonnistumista SP:n jälkeen. Toisaalta vihreän fluoresenssin havaitseminen soluissa ilman punaista fluoresenssia viittaa kalvojen SP:n esiintymiseen US-käsittelyn aikana ja sen onnistuneeseen palautumiseen kentän sammuttamisen jälkeen. Kuvassa 4 esitetään edustavia konfokaalisia fluoresenssikuvia. Näiden kahden väriaineen yhteislokalisaatio puuttuu 15′:n ajan käsitellyistä soluista, kun taas 30′:n altistuksen jälkeen sitä ei juurikaan havaita (ESI:n kuva S5). Yhdenmukaisesti paljastui ~5 %:n elinkelpoisuuden nettohäviö, mikä tarkistettiin virtaussytometrialla. Soluissa, joita sonikoitiin 45′, mikä vastaa annosta (19 ± 3) J/cm2 , yhteislokalisaatio näkyy selvemmin (ks. valkoiset nuolet kuvassa 4B) ja elinkelpoisuuden menetys on merkittävämpi (~10 %, tarkistettu virtaussytometrialla). Nämä havainnot viittaavat siihen, että pidempi altistusaika, joka vastaa suurempaa annosta kiinteällä Ispta-arvolla, aiheuttaa peruuttamattoman muutoksen kalvorakenteessa ja sitä seuraavan sytotoksisen vasteen.

Analyysi US-intensiteetin vaikutuksesta

Käytetyn US-kentän intensiteetin vaihtelun vaikutusta kalvon läpäisevyyteen analysoitiin HaCaT-solulinjalla 15′:n altistuksen jälkeen, joka oli riittävän lyhyt, jotta pitkäaikaisen sonikaation aiheuttamat vaikutukset voitiin sulkea pois. Tutkimuksessamme US-intensiteetit olivat välillä Ispta = (7 ± 1) mW/cm2 ja Ispta = (16 ± 1) mW/cm2, mikä on selvästi kavitaatiokynnyksen alapuolella24. Kohdissa 2.3 ja 2.5 kuvatun protokollan mukaisesti käytettiin FITC-merkittyjä dekstraaneja, joilla oli eri MW (MW = 10, 40 ja 70 kDa), jotta kunkin US-intensiteetin osalta voitiin karakterisoida kalvon läpäisevyyden indusoituminen eri molekyylikokoja varten. Tämän menettelyn avulla voidaan puolestaan arvioida sonohuokosten kokoa. Samoin kuin kalseiini, dekstraanit eivät pääse merkittävästi käsittelemättömiin soluihin31,32, kun taas kavitaatio-US-järjestelmässä FITC-merkittyjen dekstraanien solujen sisäänotto voi lisääntyä voimakkaasti sekä SP:n että endosomikaupan edistämisen avulla30. Tältä osin kuvassa 5 esitetyt virtaussytometriamittausten tulokset osoittavat selvästi koosta riippuvaista imeytymistä, mikä on ilmiö, jonka avulla voidaan sulkea pois aktiivisen endosytoosin samanaikaiset vaikutukset, ja kirjallisuuden22 mukaan se viittaa matalan intensiteetin laukaisemaan SP:hen pääasiallisena mekanismina, joka osallistuu dekstraanimolekyylien kuljettamiseen plasmakalvon läpi. Tarkemmin sanottuna havaitulle SP:n aiheuttamalle sisäänotolle on ominaista kynnysarvo Ispta, joka kasvaa lineaarisesti sisäistettyjen molekyylien MW:n kasvaessa. Tämän kynnysarvon alapuolella käsiteltyjen solujen ottotehokkuus on verrattavissa altistumattomien solujen vastaavaan. Ispta-kynnysarvot esitetään taulukossa 1. Kynnysarvon ylittävillä intensiteeteillä imeytymistehokkuus kasvaa Ispta-arvon kasvaessa, kunnes saavutetaan maksimi. Kun kyseessä on 10 kDa:n dekstraani, se laskee hieman tasolle asti. Havaittu imeytymistehokkuuden väheneminen suurilla intensiteeteillä voidaan selittää kuolleiden solujen määrän lisääntymisellä, sillä ne poistuvat näytteestä huuhtelun yhteydessä eivätkä siten osallistu virtaussytometrisiin analyyseihin. Lisäksi apoptoottisten prosessien aktivoituminen voi estää väriaineen sisäistymisen. Huomattavaa on, että Ispta = 15 mW/cm2:n tapauksessa, vaikka tämä arvo on paljon pienempi kuin kavitaatiokynnys, solut pystyvät sisäistämään 70 kDa:n dekstraania, jonka Stokesin halkaisija on ~12 nm. Tätä arvoa voidaan pitää arviona kalvoon syntyvien sonoporeiden vähimmäiskoosta. Kuvassa S6 (ESI:n jakso 4) on raportoitu joukko edustavia fluoresenssikuvia, joissa näkyy dekstraanin sisäänotto kynnysarvolla Ispta yhdessä PI-testin kanssa.

PI:n sisäistyminen osoittaa merkittävän sytotoksisen vasteen Ispta = 15 mW/cm2:n kohdalla (altistusannos 13,5 J/cm2). Kuten Udroiu ym.13 on raportoinut samankaltaisissa koeolosuhteissa, myös NIH-3T3-soluissa havaittiin lievää mutta merkittävää mikroytimien esiintyvyyden lisääntymistä riippuen 1 MHz:n US-altistuksen intensiteetistä ja kestosta. Nämä havainnot viittasivat siihen, että tarvitaan lisätutkimuksia, jotta voitaisiin ymmärtää paremmin kalvo-SP:hen liittyviä biologisia vaikutuksia, ja siksi tehtiin tutkimus sonikoitujen solujen biologisesta vasteesta US-intensiteetin funktiona.

Biologinen vaste SP:n aiheuttamiin ”kalvohaavoihin”, jotka aiheutettiin hyvin alhaisilla US-intensiteeteillä, luonnehdittiin perusteellisesti arvioimalla solukuolema käyttämällä kohdassa 2.5 kuvattua yhdistettyä AnnexinV:n ja PI:n määritysmenetelmää (ks. myös ESI:n kohta 5). Arvioimme myös IL-6-geenin ilmentymistä, joka on sytokiini, joka yhdistää kroonisen tulehduksen syöpään33,34. Virtaussytometria-analyysin tulokset soluprosentteina ilmaistuna esitetään kuvassa 6. Solujen elinkelpoisuus säilyy pääosin (>90 %) 15′-käsittelyjen aikana, mutta Ispta = 9 mW/cm2:stä alkaen solujen elinkelpoisuus vähenee hieman, mihin liittyy varhaisten apoptoottisten solujen lisääntyminen. Ispta = 14 mW/cm2:n kohdalla alkaa havaita merkittävää nekroottisten solujen prosenttiosuutta, kun taas Ispta = 16 mW/cm2:n kohdalla myös myöhäinen apoptoosi vaikuttaa solukuolemaan nekroosin lievää vähenemistä vastaavasti (edustavat virtaussytometriset pistekuviot ESI:n kuvassa S7). IL-6-geenin ilmentyminen määritettiin RT-PCR:llä (kuva 7). Ispta ≤15 mW/cm2:n kohdalla ei havaittu nousua, kun taas käsittely 16 mW/cm2:n kohdalla aiheutti tämän geenin yliekspressiota verrattuna käsittelemättömiin soluihin.

Nämä havainnot viittaavat siihen, että 16 mW/cm2:n Ispta-kynnysarvosta ja 15′:n sonikaatiosta alkaen US:n aiheuttama kalvovaurio ei ainoastaan vähennä solujen elinkelpoisuutta, vaan se voi myös inflammaatioon liittyvän IL-6-geenin yli-ilmentymisen kautta aiheuttaa tulehdusreaktion. Koska useissa tutkimuksissa on todettu, että tulehduksella on merkitystä sairauksien, kuten syövän, patogeneesin ja etenemisen edistämisessä35,36 , tarvitaan lisätutkimuksia, jotta tulehdusmalleihin liittyviä näkökohtia voitaisiin luonnehtia paremmin.

Sonikaatioannoksen vaikutuksen analysointi

Kvantitatiivisen analyysin tekemiseksi sovelletun amerikkalaisen kentän ja havaittujen biologisten vaikutusten välisestä suhteesta soluihin altistuksen aikana kohdistuvan energian suhteen osalta sonikaatioannos laskettiin kullekin käsittelylle intensiteetin Ispta ja altistusajan tulona. Saadut arvot esitetään taulukossa 2, jossa havaitut biologiset vaikutukset on merkitty taustaväreillä. Tuloksemme viittaavat siihen, että kalvon SP tapahtuu alkaen kynnysannoksesta, joka on noin 6,3 J/cm2. Lisäksi sonoporeiden koko voidaan suhteuttaa sonikointiannokseen. Jos annos on suurempi kuin 10,8 J/cm2, käsitellyissä soluissa havaitaan elinkelpoisuuden vähenemistä ja samanaikaista varhaista apoptoosia, jota seuraa 14,4 J/cm2:sta alkaen myöhäinen apoptoosi, nekroosi ja IL-6:n yliekspressio.

Korostamme, että tämä annos ja Ispta 16 mW/cm2 vastaavat ~0,02 MPa:n negatiivista huippupainearvoa. Tämä arvo vaikuttaa riittävän korkealta aiheuttamaan mekaanista rasitusta plasmakalvon ja veden rajapinnassa, vaikka se jääkin kertaluokkaa alemmaksi kuin tähän mennessä ehdotettu turvallisuusaltistuksen kynnysarvo (mekaaninen indeksi ~0,2-0,3, 1 MHz:n taajuudella).

Huomattakoon, että kokeitamme verrattiin menestyksekkäästi kokeiluihin, jotka suoritettiin käyttämällä elektromedikaalista järjestelmää, jota käytetään tosiasiallisesti US-terapiassa (ks. myös kohta 2.2), mikä korostaa lähestymistapamme lääketieteellistä merkitystä. Tältä osin olemme vakuuttuneita siitä, että tietojen antaminen sonikaatioannoksesta (kiinteällä US-taajuudella) mahdollistaa täydellisemmän indeksin luonnehdinnan solujen vasteesta US-altistukselle ja puolestaan sellaisten parametrien hienojakoisen tunnistamisen, joissa esiintyy ohimenevää SP:tä vähäisillä biologisilla vaurioilla.

Erittäin tärkeä askel tulostemme in vivo -biologisten vaikutusten ymmärtämiseksi olisi operoida US-altistuksia kolmiulotteisissa biosysteemeissä, kuten ihmiskudoksissa, jotka koostuvat monikerroksisista keratinosyyteistä tai veriaivoesteen endoteelisoluista.