dNTP tarkoittaa deoksiriboosinukleotiditrifosfaattia, jota käytetään PCR:ssä kasvavan DNA-juosteen pidentämiseen. dATP, dTTP, dGTP ja dTTP ovat neljä yleistä PCR:ssä käytettävää dNTP:tä.
DNTP:iden tehtävänä on pidentää kasvavaa DNA-juostetta Taq-DNA-polymeraasilla. Se sitoutuu komplementaariseen DNA-juosteeseen vetysidoksin.
PCR on DNA-synteesin in vitro -tekniikka. PCR:n suorittamisen tarkoituksena on tuottaa useita kopioita meitä kiinnostavista DNA-fragmenteista, jotta voimme visualisoida ne geelielektroforeesissa.
PCR:n tarkoituksena on valmistaa miljoonia DNA-kopioita erilaisia jatkojalostussovelluksia, kuten DNA-sekvensointia tai DNA-mikrosiruja varten.
Polymeraasiketjureaktio on vertaansa vailla oleva väline, jota käytetään molekyyligeneettisessä tutkimuksessa sen keksimisestä lähtien. DNA-malli, alukkeet, puskuri, Taq DNA-polymeraasi ja dNTP:t ovat PCR:n ainesosia. Ymmärtääksemme PCR:n mekanismin meidän pitäisi oppia jokaisen siinä käytetyn ainesosan merkitys,
Tässä artikkelissa käsittelemme yhtä PCR:n tärkeimmistä ainesosista, joka on dNTP:t. Tarkastelemme myös sen rakennetta ja sitä, miksi se on niin tärkeä.
Myös puhumme dNTP:iden ja Taq DNA-polymeraasin vuorovaikutusmekanismista ja niiden toiminnasta kasvavassa DNA-juosteessa.
Myös puhumme mekanismista, miten dNTP:t ja DNA-polymeraasi ovat vuorovaikutuksessa keskenään ja miten ne auttavat kasvattamaan DNA-juostetta.
Lue lisää PCR:ään liittyvistä artikkeleista,
- DMSO:n rooli PCR:ssä: DMSO a PCR enhancer
- Taq DNA-polymeraasin tehtävä PCR:ssä
- PCR-alkuaineiden suunnitteluohjeet
- MgCl2:n rooli PCR-reaktiossa
Keskeiset aiheet:
Mitä dNTP:t ovat?
DNTP:t ovat keinotekoisia nukleotideja, joita käytetään PCR:ssä syntetisoimaan uusia DNA-säikeitä aivan kuten DNA:n replikaatiossa. dATP, dTTP, dGTP, dTTP ovat yleisiä nukleotideja, joita on PCR:n mastermixissä.
dNTP:iden rakenne:
DNTP tarkoittaa deoksiriboosinukleotiditrifosfaattia.
Aluksi meidän on ymmärrettävä useita perusterminologioita, kuten emäs, nukleotidit, nukleosidit, nukleosidit, ribonukleotidit, deoksiribonukleotidit, dideoksiribonukleotidit, jotta voimme ymmärtää dNTP:tä. Nämä ovat perustermit, joita käytetään rutiininomaisesti genetiikassa, ja silti ihmiset ymmärtävät ne väärin.
Adeniini ja guaniini ovat puriiniperustoja, kun taas sytosiini ja tymiini ovat pyrimidiiniperustoja. Typen emäkset eivät voi muodostaa DNA:ta suoraan. DNA-molekyylin muodostamiseen tarvitaan lisäksi fosfaattirunko ja pentoosisokeri.
Nukleotidi koostuu pentoosisokerista, fosfaatista ja typpiemäksestä. Yksi nukleotidi sitoutuu toiseen viereiseen nukleotidiin fosfodiesterisidoksella, kun taas yksi nukleotidi sitoutuu toiseen DNA:n vastakkaisella säikeellä olevaan nukleotidiin vetysidoksilla.
Kuvassa on esitetty deoksiriboositrifosfaatin, -difosfaatin ja -monofosfaatin rakenne.
Lue lisää aiheesta DNA:n rakenne: DNA-tarina: DNA:n rakenne ja toiminta
Nukleotidissa oleva fosfaatti on trifosfaatti, (tri-kolme) kun fosfaatti ei ole sidoksissa nukleotidiin (tai puuttuu), sitä kutsutaan nukleosidiksi (nukleotidia, jossa ei ole fosfaattia, kutsutaan nukleosidiksi).
Kun pentoosisokerin hydroksyyliryhmän tilalle tulee vetyatomi, sokeria kutsutaan deoksisokeriksi. DNA koostuu deoksipentoosisokerista, kun taas RNA koostuu vain riboosisokerista.
DNTP:t ovat nukleotidiketjuja, jotka koostuvat riboosista, typpiemäksestä ja fosfaatista.
Edelleen ddNTP:t eroavat dNTP:istä.
Didoksinukleotiditrifosfaatilla ei ole vapaata 3′ OH-ryhmää, toinen sokerin 3′ OH-ryhmä on korvattu vedyllä.
Siten se ei voi aiheuttaa kasvavan DNA-juosteen laajenemista. Niinpä tällaisia ddATP:tä, ddTTP:tä, ddCTP:tä ja ddGTP:tä käytetään DNA:n sekvensoinnissa. Käsittelemme ddNTP:iden roolia sekvensoinnissa tarkemmin toisessa artikkelissa.
DdNTP:itä käytetään ketjun lopetusmenetelmässä pysäyttämään DNA-synteesin laajeneminen.
Kuvassa esitetään riboosisokerin, deoksiriboosisokerin ja deoksiriboosisokerin ero.
Trifosfaatti koostuu kolmesta erityyppisestä fosfaattimolekyylistä, jotka muodostavat DNA:n rungon.
DNA:n fosfaattirungossa on kolme erilaista fosfaattimolekyyliä, joita kutsutaan alfa-, beeta- ja gammafosfaatiksi. Kun yksi fosfaatti tai gammafosfaatti vapautuu, rakennetta kutsutaan deoksinukleotidifosfaatiksi.
Vaikka kun kaksi kolmesta fosfaatista vapautuu, rakennetta kutsutaan deoksinukleotidimonofosfaatiksi.
dATP ja dGTP ovat puriineja, kun taas dCTP ja dTTP ovat PCR-reaktiossa käytettäviä pyrimidiinidNTP:tä. DNTP:iden tehtävä PCR:ssä on sama kuin in vivo -replikaatiossa. Jos olet kiinnostunut lukemaan nukleotidien ja nukleosidien sekä puriinien ja pyrimidiinien eroista, lue nämä artikkelit:
- Puriinit vs. pyrimidiinit
- Nukleotidit vs. nukleosidit
Kuvassa on esitetty neljä erilaista dNTP:n rakennetta.
DNTP:iden tehtävä:
DNTP:t ovat PCR:n, RT-PCR:n, DNA-sekvensoinnin tai DNA-mikrosarjan ainesosia, jotka auttavat DNA:n kasvattamisessa tai DNA:n monistamisessa.
Vaikutusmekanismi:
PCR-prosessi jaetaan kolmeen lämpötilasta riippuvaan vaiheeseen:
- Denaturointi
- Annealing
- Extension.
Denaturointivaiheessa kaksijuosteinen DNA denaturoituu yksijuosteiseksi DNA:ksi; annealing-vaiheessa alukke sitoutuu tarkalleen siihen kohtaan, jossa sen komplementtisekvenssi on ja,
pidennysvaiheessa Taq-DNA-polymeraasi lisää dNTP:tä kasvavaan DNA-juosteeseen.
Kun säie on avattu ja alukke sitoutuu yksijuosteiseen DNA:han, Taq-DNA-polymeraasi aloittaa katalyyttisen toimintansa.
Taq-DNA-polymeraasi käyttää yksijuosteista DNA:ta entsymaattisen aktiivisuutensa substraattina ja asettuu alukkeen ja DNA:n liitoskohtaan.
Taq-DNA-polymeraasin toinen pää sitoutuu lähelle oligonukleotidin alukkeen 3′ OH-ryhmää, tätä kompleksia kutsutaan P- DNA-kompleksiksi.
Kuvassa on esitetty DNA:n rakenne vetysidoksineen ja DNA:n fosfodiesterisidoksineen.
Seuraavassa vaiheessa aloitettiin dNTP:n lisäys.
DNTP sitoutuu P-DNA-kompleksiin heikolla affiniteetilla, jos täsmälleen komplementaarinen nukleotidi on läsnä. Pian sen jälkeen Taq-DNA-polymeraasi tarttuu siihen ja komplementaarisen emäksen ja dNTP:n välille syntyy vetysidosvuorovaikutus.
Tässä alussa ei koko nukleotidi vaan dNTP:ssä oleva emäs (typpiemäs) ratkaisee, sitoutuuko se vai ei.
Ensiksi, jos se löytää komplementaarisen emäksen mallin ssDNA:sta (A T:lle ja G:lle C:lle), se muodostaa vetysidoksia niiden välille. C:n ja G:n välille syntyy kolme vetysidosta ja A:n ja T:n välille kaksi vetysidosta.
Kun vetysidos muodostuu, Taq-DNA-polymeraasi mukauttaa tuon dNTP:n sitoutumisen kasvavaan DNA-juosteeseen muodostamalla fosfodiesterisidoksen. Nyt fosfodiesterisidoksen muodostumisen jälkeen Taq-DNA-polymeraasi siirtyy askeleen eteenpäin uuden dNTP:n lisäämiseksi.
Fosfodiesterisidos muodostuu alukkeen 3′ OH:n ja dNTP:n 5′ P:n välille.
Vetysidoksen muodostumisen jälkeen Taq-DNA-polymeraasi katalysoi reaktiota poistamalla gamma- ja beetafosfaatin dNTP:n trifosfaatista. Kaksi pyrofosfaattia (PPi) vapautuu reaktion päätyttyä.
Tarkkaa kinetiikkaa siitä, miten dNTP:t ja Taq-polymeraasi ovat vuorovaikutuksessa PCR-reaktion aikana, ei vielä tunneta.
Lue lisää agaroosigeelielektroforeesista,
- Agaroosigeelielektroforeesi
- DNA-geelin latausväri
- EtBr:n rooli agaroosigeelielektroforeesissa
DNTP:iden konsentraatio PCR:ssa:
Yleensä PCR-reaktiossa, jossa ajetaan 30-35 sykliä, riittää 200μM kutakin dNTP:tä.
200μM kutakin, mikä tarkoittaa, että yhdessä PCR-reaktiossa hyödynnetään yhteensä 800μM neljää dNTP-sekoitusta. Meidän on valmistettava työkonsentraatiomme 100mM:n kantaliuoksesta.
Viime aikoina käyttövalmis mastermix on kuitenkin erittäin suosittu ja tehokas. Käyttövalmis mastermix sisältää kaikki tärkeät ainesosat, kuten dNTP-sekoituksen, geelilatausvärin ja Taq-DNA-polymeraasin.
Koska olemme luonnontieteiden opiskelijoita, meidän on nojattava siihen, miten valmistetaan työliuos varastosta. Oletetaan, että meidän täytyy valmistaa 2mM työliuos 100mM varastosta.
Nyt,
muistatko V1C1= V2C2?
Tässä annettu konsentraatio C1 on 100mM (joka on dNTP:n varastokonsentraatio)
V1 on annettu tilavuus on tuntematon (?)
C2 on tarvittava konsentraatio = 2mM
V2 on tarvittava tilavuus= 1000μL
Nyt V1C1= V2C2
V1= V2C2/ C1
V1= 1000 * 2/ 100
V1= 20μL
Tässä, 20μL kutakin dNTP:tä tarvitaan työliuoksen valmistukseen, joten lopullinen tilavuus sekoituksellemme on 80μL (dATP, dCTP, dGTP ja dTTP) 920μL D/W:ssa.
Tämä tekee loppupitoisuudeksi 2mM kutakin dNTP:tä 1000μL työliuoksessa. Laske itse 200μM:lle.
Lopullinen oppaani dNTP:iden käytöstä PCR:ssä
Valmista aina kaksi kantaliuosputkea ja säilytä kaikki putket -20°C:ssa.
Laskekaa, kuinka monta reaktiota suoritatte viikossa, valmistakaa vastaavasti kantaliuoksesta työliuos ja säilyttäkää se 4°C:ssa. Koska toistuva jäädyttäminen ja sulattaminen vähentää dNTP:iden aktiivisuutta.
Käytä aina hehkulamppuja ja ylläpidä steriilejä olosuhteita valmistellessasi työliuosta, koska vieraan DNA:n kontaminaatio haittaa PCR-reaktiota.
200μM:n konsentraatio riittää PCR-reaktioon, mutta pitkäkestoisessa PCR:ssä voidaan kuitenkin käyttää 2mM-3 mM:n konsentraatiota kutakin dNTP:tä.
Kun dNTP:n pitoisuus kasvaa, epäspesifisen sitoutumisen nopeus kasvaa. Vastaavasti dNTP:iden niukkuus johtaa epätäydellisiin PCR-tuotteisiin. Käytä siis aina sopiva määrä dNTP:tä.
Johtopäätös:
Johtopäätös: dNTP:iden tehtävä PCR-reaktiossa on yhtä tärkeä kuin Taq-DNA-polymeraasi.
Taqin avulla dNTP:t sitoutuvat kasvavaan DNA-juosteeseen ja laajentavat sitä. Jos et halua sotkea kaikkia näitä juttuja, voit käyttää valmista PCR-pakkausta, joka on suositeltavampi. Sinun on kuitenkin opeteltava reagenssien manuaalinen valmistusmenetelmä.