Abstract
Difenhydramiini (DPH) on yleinen reseptivapaasti myytävä antihistamiini, joka aiheuttaa uneliaisuutta ja voi aiheuttaa ajamista huumausaineiden vaikutuksen alaisena-liittyvät onnettomuudet. Toistaiseksi ei ole kaupallisesti saatavilla immunomäärityssarjoja sen osoittamiseksi biologisista nesteistä, kuten virtsasta ja/tai verestä. Kuvaamme äskettäin kehitetyn entsyymisidonnaisen immunosorbenttimäärityksen (ELISA) seulan ja raportoimme sen hyödyllisyydestä vapaaehtoisilta otettujen aitojen näytteiden analysoinnissa. Määritys on spesifinen DPH:n havaitsemiseksi, eikä se havaitse läheisesti sukua olevia antihistamiineja, kuten bromfeniramiinia, kloorifeniramiinia ja doksyyliamiinia. Ristireaktiivisuutta esiintyy vaihtelevasti tiettyjen trisyklisten yhdisteiden kanssa, koska niiden sivuketjurakenne on samankaltainen DPH:n kanssa. Määrityksen päivänsisäisen ja päivänvälisen tarkkuuden todettiin olevan alle 10 %. Määritys on erittäin herkkä, ja sen toiminta-alue on 1-500 ng/ml virtsassa ja 1-250 ng/ml veressä. Määritys validoitiin edelleen vapaaehtoisilta ja kuolinsyyntutkijalaboratorioista saaduilla aidoilla virtsa- ja verinäytteillä.
Esittely
Difenhydramiini (DPH), 2-difenyylimetoksi-N,N-dimetyylietanamiini, on etanoliamiinipohjainen antihistamiini. Se oli yksi ensimmäisistä vuonna 1946 löydetyistä antihistamiinisista aineista, ja sitä käytetään laajalti lievittämään tavallisia allergiaoireita. DPH vaikuttaa estämällä histamiinin vaikutuksia H1-reseptorikohdissa, ja se on myös CYP2D6:n estäjä ja keskushermoston (CNS) lamaannuttaja. Sen lisäksi, että se on antihistamiini, sitä käytetään myös antiemeettisenä, yskänlääkkeenä ja rauhoittavana aineena. Vaikka DPH on tehokas, sillä on useita haittavaikutuksia, joita ovat muun muassa uneliaisuus, liikehäiriöt, nopea sydämen syke ja näön hämärtyminen (1, 2), joten sen on raportoitu olevan riskitekijä vaarallisissa ajotilanteissa (3-5). DPH:n yhteisvaikutukset muiden lääkkeiden ja/tai alkoholin kanssa voivat entisestään lisätä ajamiseen liittyvien onnettomuuksien ja kuolemantapausten riskiä.
Antihistamiinit luokitellaan laajasti ensimmäisen sukupolven, toisen sukupolven ja reseptilääkkeillä saataviin antihistamiineihin. Ensimmäisen sukupolven antihistamiinit, joihin kuuluu DPH (Benadryl™), ovat kaikki saatavilla reseptivapaasti ja aiheuttavat merkittävää uneliaisuutta. Tähän luokkaan kuuluvia sukulaisantihistamiineja ovat kloorifeniramiini (Singlet™), bromifeniramiini (Dimetapp™) ja doksyyliamiini (Vicks NyQuil™). Toinen ensimmäisen sukupolven antihistamiini on DPH:n 8-klooriteofylinaattisuola, joka tunnetaan nimellä dimenhydrinaatti (Dramamine™) ja jota määrätään matkapahoinvointiin. Toisen sukupolven antihistamiinit ovat loratadiini (Claritin™), desloratadiini (Clarinex™), akrivastiini (Semprex-D™), ebastiini (Kestine™), setiritsiini (Zyrtec™) ja fexofenadiini (Allegra™), jotka ovat unettomia vaihtoehtoja DPH:lle. Kuvassa 1 esitetään yleisesti esiintyvien antihistamiinien kemialliset rakenteet.
Antihistamiinien kemialliset rakenteet.
Antihistamiinien kemialliset rakenteet.
DPH:n unta aiheuttavat vaikutukset ovat johtaneet sen yhdistämiseen muihin lääkkeisiin, kuten parasetamoliin, Tylenol PM™:n kaltaisissa valmisteissa tai nenän dekongestanttien, kuten pseudoefedriinin, kanssa. Vaikka DPH on yksi vanhimmista antihistamiineista, sitä on helposti saatavilla reseptivapaasti ja se on tehokkaampi ja nopeavaikutteisempi kuin jotkin uusimmista reseptilääkkeistä, minkä vuoksi sitä käytetään laajalti (6). Benadrylin varoitusetiketissä kerrotaan selvästi lääkkeen ottamisen jälkeisen ajamisen vaarallisuudesta. Lisäksi lukuisat tutkimukset ovat selvästi osoittaneet, että DPH:n ja toisen sukupolven antihistamiinin tai jopa alkoholin käytön jälkeen motoriset taidot ja kognitiivinen suorituskyky ovat heikentyneet, mikä liittyy monimutkaiseen tehtävään eli autojen käyttämiseen (7-12). On myös tehty tutkimus lisääntyneestä loukkaantumisriskistä DPH:n käytön jälkeen verrattuna toisen sukupolven antihistamiineihin (13). Nämä tutkimukset perustelevat selvästi ensisijaisesti DPH:n testaamisen tärkeyttä.
DPH:ta on saatavana useissa eri annosmuodoissa, kuten nesteenä, tabletteina, kapseleina, purukumeina ja paikallisesti käytettävinä voiteina. Aikuisille suositeltu annos on välillä 25-50 mg 4-6 tunnin välein, ei kuitenkaan yli 50-100 mg (1). Kun DPH otetaan, se imeytyy nopeasti elimistöön, ja suurin aktiivisuus havaitaan noin 1 tunnin kuluttua lääkkeen ottamisesta. DPH:n puoliintumisaika on noin 2-9 tuntia, ja huippupitoisuudet plasmassa saavutetaan noin 1-4 tunnin kuluttua annoksen ottamisesta. Suun kautta otetun 50 mg:n kerta-annoksen jälkeen plasman keskimääräiset huippupitoisuudet, 83 ng/ml difenhydramiinia, havaittiin 3 tunnin kuluttua, minkä jälkeen ne laskivat 9 ng/ml:iin 24 tuntiin mennessä (14). Suun kautta otetun 100 mg:n DPH-kerta-annoksen keskimääräiset huippupitoisuudet plasmassa olivat 112 ng/ml 2 tuntia annoksen jälkeen (15). Antihistamiinien teho näkyy yli 25 ng/ml:n pitoisuuksissa, uneliaisuutta voidaan havaita 30-40 ng/ml:n pitoisuuksissa ja psyykkistä heikentymistä yli 60 ng/ml:n pitoisuuksissa (16). On raportoitu, että DPH:n terapeuttiset pitoisuudet veressä vaihtelevat välillä 25-112 ng/ml, toksiset pitoisuudet ovat noin 5000 ng/ml ja tappavat pitoisuudet missä tahansa yli 8000 ng/ml (3, 17). DPH:n väärinkäyttötapauksia on myös dokumentoitu useiden vuosien ajan (18-20).
DPH:n in vivo -metabolia johtaa siihen, että noin 30 % annoksesta muuntuu N-desmetyylimetaboliitiksi, jonka jälkeen muodostuu N,N-didesmetyylimetaboliitti ja 13 % annoksesta muuntuu amiinin kautta asetyylimetaboliiteiksi. Pieni osa muuttuu difenyylimetoksietikkahapoksi, ja loput suuri osa annoksesta erittyy muuttumattomana kantalääkkeenä (21, 22). Difenhydramiinin metabolia on esitetty kuvassa 2.
Difenhydramiinin metabolia in vivo.
Difenhydramiinin metabolia in vivo.
Traditionaaliset menetelmät DPH:n testaamiseksi ihmisen plasmasta ovat edellyttäneet kallista ja aikaa vievää näytteen uuttamista, jota ovat seuranneet varmistusmenettelyt. Useat ryhmät ovat raportoineet käyttävänsä erilaisia kaasukromatografisia (GC) menetelmiä DPH:n osoittamiseksi plasmasta ja virtsasta (23-27). On myös raportoitu kapillaarielektroforeesimenetelmistä (28) ja nestekromatografiamassaspektrometrisistä (LC-MS) menetelmistä (29), joita on kehitetty DPH:n osoittamiseksi. Toistaiseksi kirjallisuudessa ei ole raportoitu difenhydramiinin seulonnasta ELISA- tai muulla immunomääritysmenetelmällä. Tässä julkaisussa raportoimme ensimmäisestä ELISA-seulontamenetelmästä DPH:n osoittamiseksi ihmisen virtsasta ja verestä.
Toksikologian laboratorioissa pidetään vakiokäytäntönä suorittaa immunomääritysseulonta, jossa positiiviset näytteet tunnistetaan ensin ja varmistetaan edelleen GC-MS- tai LC-MS-tekniikalla. Useimmat toksikologian laboratoriot käyttävät tätä kustannus-hyöty-strategiana sen sijaan, että jokaisesta vastaanotetusta näytteestä tehtäisiin kalliimpi varmistusmenetelmä. Näin ollen olisi hyödyllistä kehittää luotettava ELISA-seulontamenetelmä, jota voitaisiin soveltaa DPH:n näytteisiin, jotka liittyvät ajo-onnettomuuksiin ja kuolemantapauksiin. Tätä tavoitetta varten toksikologit ovat esittäneet rattijuopumuksen tunnistamista koskevia suosituksia, joihin sisältyy ehdotettu DPH:n raja-arvoksi 25 ng/ml veressä ja 50 ng/ml virtsassa (30). Tässä artikkelissa kuvataan vankka ja tarkka ELISA-seulontamenetelmä DPH:n määrittämiseksi ihmisen virtsasta ja verestä näiden ehdotettujen ohjeiden mukaisesti.
Kokeellinen
Materiaalit
Reagenssit ja kemikaalit. Difenhydramiini saatiin Sigma-Aldrichilta (Milwaukee, WI) ja difenhydramiini-d3 (100 μg/ml liuos metanoliin) saatiin Cerilliantilta (Round Rock, TX). DPH-spesifisen polyklonaalisen vasta-aineen kasvatti Immunalysis (Pomona, CA), ja DPH-hapteenit ja piparjuuriperoksidaasilla leimatut konjugaatit syntetisoitiin Immunalysessä. Kolorimetrisessä reaktiossa käytetty substraattireagenssi 3,3′,5,5′-tetrametyylibentsidiini (TMB) saatiin Pierceltä (Rockford, IL). Prosessissa käytetyt entsyymit olivat naudan tyroglobuliini (BTG), joka saatiin Sigma-Aldrichilta (Milwaukee, WI), piparjuuriperoksidaasi (HRP), joka saatiin BBI Enzymesiltä (Madison, WI), ja naudan seerumin albumiini (BSA), joka saatiin Proliant Biologicalsilta (Boone, IA). Kaikki käytetyt liuottimet olivat HPLC-laatua, ja kaikki kemikaalit olivat ACS-laatua, ja ne saatiin Spectrum Chemicalsilta (Gardena, CA). ELISA-menetelmää varten DPH:n korkeat 1000 ng/ml:n kalibraattorit valmistettiin synteettisestä negatiivisesta virtsasta ja synteettisestä negatiivisesta verestä ja säilytettiin 4 °C:ssa. Tässä määrityksessä käytetyt synteettinen negatiivinen virtsa ja synteettinen negatiivinen veri on valmistettu kyseisissä matriiseissa esiintyvistä ainesosista, ja ne vastasivat kolmen negatiivisen ihmisen virtsa- ja verinäytteen immunomääritysreaktioita (31, 32). Synteettinen negatiivinen virtsa koostuu 0,1-prosenttisesta BSA-liuoksesta deionisoidussa vedessä, jossa on 0,2-prosenttista FD&C-keltaista #6-väriainetta, ja synteettinen negatiivinen veri koostuu Immunalysiksen omasta valmisteesta.
LAITTEISTO. HiTrap protein G HP -affiniteettikolonnit, joita käytettiin immunoglobuliini G:n (IgG) puhdistamiseen, ostettiin GE Healthcare:ltä (Pittsburgh, PA). Tavalliset polystyreenimikrotiterilevyt (96 kuoppaa) hankittiin Corning Costarilta (Corning, NY). Tecan Columbus Pro -mikrotiterilevyjen pesukone ja Tecan Sunrise -levynlukija hankittiin Tecanilta (San Jose, CA). Immunomäärityksen kehitysprosessin aikana käytetyt pipetit saatiin Rainin Instrumentsilta (Oakland, CA). LC-MS-MS-analyysissä käytetty 6410-kolmiokvadrupoli-MS ja Zorbax Eclipse XDB C18 -kolonni hankittiin Agilent Technologiesilta (Santa Clara, CA).
Menetelmät
ELISA. ELISA-menetelmän kehittämisen ensisijainen vaihe käsitti polyklonaalisten vasta-aineiden tuottamisen, jotka perustuivat valitun eläinlajin immunokemialliseen vasteeseen DPH-spesifiselle antigeenille. Tätä tarkoitusta varten kaniinit immunisoitiin ensin DPH-antigeenillä, joka koostui naudan tyroglobuliiniin (BTG) konjugoidusta DPH:sta. Immunisointiprosessi ja kanien verenlasku annettiin erikoistuneen eläinlaitoksen tehtäväksi. Kaneista saatu seerumi puhdistettiin talon sisällä affiniteettikromatografialla eluoimalla proteiini-G-pylväiden läpi, jotta saatiin puhdistettu IgG-fraktio. Tämän jälkeen DPH-spesifinen polyklonaalinen IgG immobilisoitiin 96-kuoppaisille polystyreenimikrotiterilevyille. Ylimääräinen vasta-aine imettiin pois, vapaat vasta-aineen sitoutumiskohdat estettiin 1-prosenttisella trehaloosiliuoksella vedessä ja levyt kuivattiin tyhjiöuunissa 37 °C:ssa yön yli. Levyt säilytettiin edelleen suljetussa pussissa, jossa oli kuivausainetta, koska on tärkeää, että ne eivät sisällä kosteutta. DPH:n virtsan annos-vastekäyrä valmistettiin ensin väkevöimällä negatiivista synteettistä virtsaa 1, 2, 5, 10, 25, 50, 100, 250 ja 500 ng/ml:lla lääkkeen korkean kalibraattorin varastoliuoksesta. Verikäyrä saatiin vahvistamalla negatiivista synteettistä verta 1, 5, 10, 25, 50, 100 ja 250 ng/ml:lla korkeasta kalibraattoriliuoksesta. Nämä synteettisen veren kalibraattorit laimennettiin edelleen 1:10 100 mM fosfaattipuskurilla, joka sisälsi 150 mM natriumkloridia (fosfaattipuskuroitu suolaliuos, pH 7,0), ennen analysointia. Kaikki verinäytteet laimennettiin vastaavasti 1:10 fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (pH 7,0). Virtsanäytteet laimennettiin myös 1:20 100 mM fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (pH 7,0). Kalibraattorit ja näytteet pipetoitiin sitten kahtena kappaleena mikrotiterilevyn kuoppiin käyttäen 10 μl:n näytekokoa sekä virtsan että veren osalta. Tämän jälkeen lisättiin 100 μl entsyymikonjugaattia, joka koostui HRP:llä leimatusta difenhydramiinista. Levyn annettiin sitten inkuboitua 1 tunnin ajan pimeässä huoneenlämmössä. Sen jälkeen kuopat pestiin kuusi kertaa 350 μl:lla deionisoitua vettä mikrotiterilevyn pesurilla, imettiin veden poistamiseksi, käännettiin ja lyötiin kuivaksi jäljellä olevan veden poistamiseksi kuopista. Kromogeeninen TMB-substraatti (100 μL) lisättiin sitten kuhunkin kuoppaan ja levyä inkuboitiin vielä 30 minuuttia pimeässä. Tämän jälkeen reaktio pysäytettiin 100 μl:lla 1 N suolahappoa keltaisen värin aikaansaamiseksi. Määritys on kolorimetrinen, ja absorbanssi luettiin kahdella aallonpituudella 450 nm ja 650 nm mikrotiterilevyjen lukulaitteella. Aallonpituudella 650 nm mitataan tausta-absorbanssi, jonka levylukija sitten vähentää lopullisesta absorbanssista. Tuotetun värin intensiteetti on kääntäen verrannollinen näytteen analyyttipitoisuuteen.
LC-MS-MS. Analyysissä käytettiin 1200-sarjan LC-pumppua, joka oli kytketty 6410-kolmiokvadrupoli-MS:ään, joka toimi positiivisessa sähkösuihkuionisaatiomoodissa (ESI). LC-MS-MS-kolonnina käytettiin Zorbax Eclipse XDB C18 (4,6 × 50 mm × 1,8 µm). Analyysinäyte valmistettiin seuraavasti: 100 µl virtsanäytettä, joka sisälsi 50 µl difenhydramiini-d3:a (200 ng/ml), lisättiin autosampleripulloon. Näytteet ruiskutettiin suoraan LC-MS-MS:ään autoinjektorin avulla. Kolonnin lämpötila pidettiin 60 °C:ssa, ja injektiotilavuus oli 5 µl. Liikkuva faasi koostui 0,2 % etikkahaposta pH 4 (liuotin A) ja metanolista (liuotin B). Aluksi liikkuvan faasin koostumus oli 100 % A virtausnopeudella 0,7 ml/min 6 minuutin ajan, sitten metanolin prosenttiosuus nostettiin 100 %:iin ja palattiin taas 100 %:iin A:han 7 minuutin kuluttua.
Kaasun lämpötila oli 350 °C, kaasuvirtaus oli 10 l/min ja sumuttimen paine pidettiin 50 psi:ssä. Törmäyskaasuna käytettiin typpeä ja kapillaarijännite oli 4000 V. Kullekin lääkkeelle valittiin ja optimoitiin kaksi siirtymää. Pysähdysaika oli 50 ms, ja optimaalinen fragmentaattorin energia oli 80 V kaikille siirtymille. Optimaaliset törmäysenergiajännitteet määritettiin 35 V:ksi deuteroidulle sisäiselle standardille (difenhydramiini-d3), 15 V:ksi primääriselle siirtymälle ja 30 V:ksi sekundääriselle siirtymälle itse difenhydramiinille. Kvalifioivan siirtymän ja kvantifioivan siirtymän suhde määritettiin suunnilleen kalibrointialueen keskikohdassa: 100 ng/ml. Difenhydramiini-d3:n siirtymä oli 259,7 > 165,2; difenhydramiinin primäärinen (kvantifioiva) siirtymä oli 256,7 > 167,2; kvalifioiva (sekundäärinen) siirtymä 256,7 > 152,2. Merkitsemätön difenhydramiini voi hajota m/z 167 tai 165 tuoteioniksi prekursori-ionista riippuen käytetystä törmäysenergiasta. Menetelmämme validoitiin käyttämällä kuvattuja olosuhteita. LC-MS-MS-menetelmän havaitsemisraja (LOD) oli 10 ng/ml, ja se määritettiin pienimmäksi havaittavaksi pitoisuudeksi signaali/kohinasuhteella > 2.
Tulokset ja keskustelu
annos-vastekäyrä
Menetelmässä hyödynnetään entsyymikonjugaatin ja näytteessä olevan vapaan analyytin välistä kilpailevaa sitoutumista kiinteästä määrästä vasta-aineen sitoutumiskohtia, joka on verrannollinen niiden pitoisuuteen seoksessa. DPH:n annos-vastekäyrät valmistettiin synteettisestä negatiivisesta virtsasta ja synteettisestä negatiivisesta verestä aiemmin kuvatuilla pitoisuuksilla. B0 on negatiivisen kalibraattorin absorbanssi, ja B edustaa yksittäisten kalibraattoritasojen absorbanssia. Yksittäisen kalibraattorin ja negatiivisen kalibraattorin prosentuaalinen suhde (B/B0) laskettiin kullekin kalibraattoritasolle ja piirrettiin sekä virtsan että veren lääkeainekonsentraation (ng/ml) suhteen (kuva 3). B/B0-arvot ovat kääntäen verrannollisia näytteen lääkeainekonsentraatioon, mikä johtuu siitä, että mitä suurempi lääkeainekonsentraatio on, sitä vähemmän lääke-entsyymikonjugaatti sitoutuu vasta-aineeseen, jolloin absorbanssiarvo on pienempi.
Difenhydramiinin annos-vastekäyrät nesteessä ja veressä.
LOD ja cutoff
DPH-määrityksen LOD määritettiin pienimmäksi pitoisuudeksi, joka voidaan mitata tarkasti käyttämällä kuvattuja määrityksen parametreja. Kolmea lääkkeetöntä aitoa virtsanäytettä väkevöitiin vaihtelevilla DPH-pitoisuuksilla 1 ng/ml:iin asti ja analysoitiin sitten kahtena kappaleena. Pienin kahden standardipoikkeaman perusteella laskettu arvo saatiin, ja tämän tuloksen perusteella määrityksen LOD-arvoksi määritettiin 1 ng/ml. Raja-arvopitoisuudeksi määritettiin 50 ng/ml virtsalle ja 25 ng/ml verelle. Molemmat määritettiin optimaalisiksi ratkaisupisteiksi annos-vastekäyrän lineaarisessa osassa olevien kalibraattoreiden kahden standardipoikkeaman perusteella sekä pitämällä mielessä toksikologian alalla laaditut suositellut ohjeet.
Selektiivisyys
Sukulaisyhdisteiden ja ei-sukulaisyhdisteiden aiheuttamaa interferenssiä tutkittiin piikittämällä kyseisiä aineita synteettiseen negatiiviseen virtsaan ja ajamalla ne ELISA-määrityksessä. Taulukossa I esitetään ristireaktiivisuustiedot yhdisteiden kanssa, jotka ovat rakenteeltaan ja farmakologiselta aktiivisuudeltaan läheisesti sukua difenhydramiinille ja joiden todettiin olevan enintään 1 % määrityksen raja-arvolla 50 ng/ml. Orfenadriini, joka on sekä lihasrelaksantti että antihistamiininen aine, reagoi ristiin määrityksen kanssa 42-prosenttisesti, koska sillä on hyvin samanlainen rakenne kuin DPH:lla, vaikkakin yksi metyylisubstituenttiryhmä. Mitään kuvassa 2 esitetyistä DPH:n aineenvaihduntatuotteista ei seulottu ristireagoiviksi tässä määrityksessä, koska niitä ei ollut tuolloin kaupallisesti saatavilla.
Ristireaktiivisuus rakenteellisesti ja farmakologisesti sukua olevien yhdisteiden kanssa
| Lääke . | Pitoisuus (ng/ml) . | % ristireaktiivisuus . |
|---|---|---|
| Bromifeniramiini | 500 | 0.82 |
| Kloorifeniramiini | 500 | 0.50 |
| Doksyyliamiini | 1000 | 0.49 |
| Orfenadriini | 1000 | 42.00 |
| Lääke . | Pitoisuus (ng/ml) . | % ristireaktiivisuus . |
|---|---|---|
| Bromfeniramiini | 500 | 0.82 |
| Kloorifeniramiini | 500 | 0.50 |
| Doksyyliamiini | 1000 | 0.49 |
| Orfenadriini | 1000 | 42.00 |
Ristireaktiivisuus rakenteellisesti ja farmakologisesti sukulaisyhdisteiden kanssa
| Lääke . | Pitoisuus (ng/ml) . | % ristireaktiivisuus . |
|---|---|---|
| Bromifeniramiini | 500 | 0.82 |
| Kloorifeniramiini | 500 | 0.50 |
| Doksyyliamiini | 1000 | 0.49 |
| Orfenadriini | 1000 | 42.00 |
| Lääke . | Pitoisuus (ng/ml) . | % ristireaktiivisuus . |
|---|---|---|
| Bromfeniramiini | 500 | 0.82 |
| Kloorifeniramiini | 500 | 0.50 |
| Doksyyliamiini | 1000 | 0.49 |
| Orfenadriini | 1000 | 42.00 |
Yhdisteet, jotka eivät liittyneet DPH:han, analysoitiin myös 100 000 ng/ml:n pitoisuuksina testissä. Taulukossa II esitetään ristireaktiivisuus näiden muiden kuin sukua olevien yhdisteiden kanssa. Useimmat näistä yhdisteistä eivät häirinneet DPH:n havaitsemista määrityksessä. Sivuketjurakenteen samankaltaisuuden vuoksi useilla yhdisteillä, kuten amitriptyliinillä, klooripromatsiinilla, klomipramiinilla, doksepiinillä, imipramiinilla ja syklobensapriinilla, oli eriasteista ristireaktiivisuutta määrityksessä. Varmistusmenetelmillä suljettaisiin mieluiten pois kaikki ELISA-testillä havaitut väärät positiiviset tulokset, jotka johtuvat näistä ristireagoivista aineista, jotka voisivat häiritä DPH-määritystä. DPH:sta vapaiden aitojen virtsa- ja verinäytteiden matriisivaikutuksia tutkittiin myös niiden vaikutusten määrittämiseksi määritykseen. Virtsan ja veren matriiseista johtuvia epätoivottuja vääriä positiivisia tuloksia ei havaittu, kun määrityksessä käytettiin LC-MS-MS-varmennettuja DPH-vapaita virtsa- ja verinäytteitä.
Ristireaktiivisuus toisiinsa liittymättömien yhdisteiden kanssa
| Lääke . | Pitoisuus (ng/ml) . | % ristireaktiivisuus . |
|---|---|---|
| Amitriptyliini | 500 | 0.82 |
| Klooripromatsiini | 500 | 0.50 |
| Klomipramiini | 1000 | 0.49 |
| Syklobensapriini | 100 | 250.00 |
| Doxepiini | 100 | 47.10 |
| Imipramiini | 250 | 11.80 |
| Norclomipramine | 2000 | 0.57 |
| Nordoxepin | 4000 | 0.19 |
| Protriptyliini | 500 | 0.52 |
| Trimipramiini | 500 | 4.08 |
| Desipramiini | 20,000 | 0.10 |
| Bentsyylipiperatsiini | 100,000 | ND* |
| Karbamatsepiini | 100,000 | ND |
| kokaiini | 100,000 | ND |
| Kodeiini | 100,000 | ND |
| Deksstrometorfaani | 100,000 | ND |
| Diatsepaami | 100,000 | ND |
| EDDP | 100,000 | ND |
| Efedriini | 100,000 | ND |
| Flunitratsepaami | 100,000,000 | ND |
| Fluratsepaami | 100,000 | ND |
| Glutetimidi | 100,000 | ND |
| Ketamiini | 100,000 | ND |
| Lidokaiini | 100,000 | ND |
| MDMA | 100,000 | ND |
| Metadoni | 100,000 | ND |
| Metamfetamiini | 100,000 | ND |
| Metaqualoni | 100,000 | ND |
| PCP | 100,000 | ND |
| Pentatsosiini | 100,000 | ND |
| fenobarbitaali | 100,000 | ND |
| PMA | 100,000 | ND |
| Propoksifeeni | 100,000 | ND |
| 3-TFMPP | 100,000 | ND |
| Lääke . | Pitoisuus (ng/ml) . | % ristireaktiivisuus . |
|---|---|---|
| Amitriptyliini | 500 | 0.82 |
| Klooripromatsiini | 500 | 0.50 |
| Klomipramiini | 1000 | 0.49 |
| Syklobensapriini | 100 | 250.00 |
| Doxepiini | 100 | 47.10 |
| Imipramiini | 250 | 11.80 |
| Norclomipramine | 2000 | 0.57 |
| Nordoxepin | 4000 | 0.19 |
| Protriptyliini | 500 | 0.52 |
| Trimipramiini | 500 | 4.08 |
| Desipramiini | 20,000 | 0.10 |
| Bentsyylipiperatsiini | 100,000 | ND* |
| Karbamatsepiini | 100,000 | ND |
| kokaiini | 100,000 | ND |
| Kodeiini | 100,000 | ND |
| Deksstrometorfaani | 100,000 | ND |
| Diatsepaami | 100,000 | ND |
| EDDP | 100,000 | ND |
| Efedriini | 100,000 | ND |
| Flunitratsepaami | 100,000,000 | ND |
| Fluratsepaami | 100,000 | ND |
| Glutetimidi | 100,000 | ND |
| Ketamiini | 100,000 | ND |
| Lidokaiini | 100,000 | ND |
| MDMA | 100,000 | ND |
| Metadoni | 100,000 | ND |
| Metamfetamiini | 100,000 | ND |
| Metaqualoni | 100,000 | ND |
| PCP | 100,000 | ND |
| Pentatsosiini | 100,000 | ND |
| fenobarbitaali | 100,000 | ND |
| PMA | 100,000 | ND |
| Propoksifeeni | 100,000 | ND |
| 3-TFMPP | 100,000 | ND |
* ND = ei havaittu.
Ristireaktiivisuus toisiinsa liittymättömien yhdisteiden kanssa
| Lääke . | Pitoisuus (ng/ml) . | % ristireaktiivisuus . |
|---|---|---|
| Amitriptyliini | 500 | 0.82 |
| Klooripromatsiini | 500 | 0.50 |
| Klomipramiini | 1000 | 0.49 |
| Syklobensapriini | 100 | 250.00 |
| Doxepiini | 100 | 47.10 |
| Imipramiini | 250 | 11.80 |
| Norclomipramine | 2000 | 0.57 |
| Nordoxepin | 4000 | 0.19 |
| Protriptyliini | 500 | 0.52 |
| Trimipramiini | 500 | 4.08 |
| Desipramiini | 20,000 | 0.10 |
| Bentsyylipiperatsiini | 100,000 | ND* |
| Karbamatsepiini | 100,000 | ND |
| kokaiini | 100,000 | ND |
| Kodeiini | 100,000 | ND |
| Deksstrometorfaani | 100,000 | ND |
| Diatsepaami | 100,000 | ND |
| EDDP | 100,000 | ND |
| Efedriini | 100,000 | ND |
| Flunitratsepaami | 100,000,000 | ND |
| Fluratsepaami | 100,000 | ND |
| Glutetimidi | 100,000 | ND |
| Ketamiini | 100,000 | ND |
| Lidokaiini | 100,000 | ND |
| MDMA | 100,000 | ND |
| Metadoni | 100,000 | ND |
| Metamfetamiini | 100,000 | ND |
| Metaqualoni | 100,000 | ND |
| PCP | 100,000 | ND |
| Pentatsosiini | 100,000 | ND |
| fenobarbitaali | 100,000 | ND |
| PMA | 100,000 | ND |
| Propoksifeeni | 100,000 | ND |
| 3-TFMPP | 100,000 | ND |
| Lääke . | Pitoisuus (ng/ml) . | % ristireaktiivisuus . |
|---|---|---|
| Amitriptyliini | 500 | 0.82 |
| Klooripromatsiini | 500 | 0.50 |
| Klomipramiini | 1000 | 0.49 |
| Syklobensapriini | 100 | 250.00 |
| Doxepiini | 100 | 47.10 |
| Imipramiini | 250 | 11.80 |
| Norclomipramiini | 2000 | 0.57 |
| Nordoksipiini | 4000 | 0.19 |
| Protriptyliini | 500 | 0.52 |
| Trimipramiini | 500 | 4.08 |
| Desipramiini | 20,000 | 0.10 |
| Bentsyylipiperatsiini | 100,000 | ND* |
| Karbamatsepiini | 100,000 | ND |
| kokaiini | 100,000 | ND |
| Kodeiini | 100,000 | ND |
| Deksstrometorfaani | 100,000 | ND |
| Diatsepaami | 100,000 | ND |
| EDDP | 100,000 | ND |
| Efedriini | 100,000 | ND |
| Flunitratsepaami | 100,000,000 | ND |
| Fluratsepaami | 100,000 | ND |
| Glutetimidi | 100,000 | ND |
| Ketamiini | 100,000 | ND |
| Lidokaiini | 100,000 | ND |
| MDMA | 100,000 | ND |
| Metadoni | 100,000 | ND |
| Metamfetamiini | 100,000 | ND |
| Metaqualoni | 100,000 | ND |
| PCP | 100,000 | ND |
| Pentatsosiini | 100,000 | ND |
| fenobarbitaali | 100,000 | ND |
| PMA | 100,000 | ND |
| Propoksifeeni | 100,000 | ND |
| 3-TFMPP | 100,000 | ND |
* ND = ei havaittu.
Tarkkuus
ELISA:n päivänsisäiset ja -väliset tarkkuudet suoritettiin vain synteettisestä virtsasta pitoisuuksilla 0, 5, 10, 25 ja 50 ng/ml. Päivänsisäinen tarkkuus laskettiin variaatiokertoimena (CV%) kahdeksasta samana päivänä tehdystä analyysistä (n = 8), ja se oli alle 10 %, ja päivänsisäinen tarkkuus (CV%) laskettiin kahdeksasta analyysistä päivässä 10 päivän aikana (n = 80), ja sen todettiin myös olevan alle 10 %. Tiedot esitetään taulukossa III.
ELISA:n päivänsisäiset ja päivänväliset tarkkuudet
| Lääkkeen pitoisuus (ng/ml) . | Keskimääräinen Abs. . | SD . | CV% . |
|---|---|---|---|
| Päivänsisäinen tarkkuus (n = 8) | |||
| 0 | 3.30 | 0.04 | 1.06 |
| 5 | 2.07 | 0.09 | 4.18 |
| 10 | 1.83 | 0.04 | 2.04 |
| 25 | 1.57 | 0.06 | 3.99 |
| 50 | 1.40 | 0.02 | 1.46 |
| Välipäivän tarkkuus (n = 80) | |||
| 0 | 3.44 | 0.12 | 3.60 |
| 5 | 2.28 | 0.20 | 8.70 |
| 10 | 1.99 | 0.18 | 9.02 |
| 25 | 1.67 | 0.15 | 8.74 |
| 50 | 1.50 | 0.13 | 8.85 |
| Lääkkeen pitoisuus (ng/ml) . | Keskimääräinen Abs. . | SD . | CV% . | |
|---|---|---|---|---|
| Päivänsisäinen tarkkuus (n = 8) | ||||
| 0 | 3.30 | 0 .04 | 1.06 | |
| 5 | 2.07 | 0.09 | 4.18 | |
| 10 | 1.83 | 0.04 | 2.04 | |
| 25 | 1.57 | 0.06 | 3.99 | |
| 50 | 1.40 | 0.02 | 1.46 | |
| Välipäivän tarkkuus (n = 80) | ||||
| 0 | 3.44 | 0.12 | 3.60 | |
| 5 | 2.28 | 0.20 | 8.70 | |
| 10 | 1.99 | 0.18 | 9.02 | |
| 25 | 1.67 | 0.15 | 8.74 | |
| 50 | 1.50 | 0.13 | 8.85 |
ELISA:n päivänsisäiset ja vuorokausien väliset tarkkuudet
| Lääkkeen pitoisuus (ng/ml) . | Mean Abs. . | SD . | CV% . |
|---|---|---|---|
| Päivänsisäinen tarkkuus (n = 8) | |||
| 0 | 3.30 | 0.04 | 1.06 |
| 5 | 2.07 | 0.09 | 4.18 |
| 10 | 1.83 | 0.04 | 2.04 |
| 25 | 1.57 | 0.06 | 3.99 |
| 50 | 1.40 | 0.02 | 1.46 |
| Välipäivän tarkkuus (n = 80) | |||
| 0 | 3.44 | 0.12 | 3.60 |
| 5 | 2.28 | 0.20 | 8.70 |
| 10 | 1.99 | 0.18 | 9.02 |
| 25 | 1.67 | 0.15 | 8.74 |
| 50 | 1.50 | 0.13 | 8.85 |
| Lääkkeen pitoisuus (ng/ml) . | Mean Abs. . | SD . | CV% . | |
|---|---|---|---|---|
| Päivänsisäinen tarkkuus (n = 8) | ||||
| 0 | 3.30 | 0 .04 | 1.06 | |
| 5 | 2.07 | 0.09 | 4.18 | |
| 10 | 1.83 | 0.04 | 2.04 | |
| 25 | 1.57 | 0.06 | 3.99 | |
| 50 | 1.40 | 0.02 | 1.46 | |
| Välipäivän tarkkuus (n = 80) | ||||
| 0 | 3.44 | 0.12 | 3.60 | |
| 5 | 2.28 | 0.20 | 8.70 | |
| 10 | 1.99 | 0.18 | 9.02 | |
| 25 | 1.67 | 0.15 | 8.74 | |
| 50 | 1.50 | 0.13 | 8.85 |
Määrityksen säilyvyys ja säilyvyysaika
Valmisteen säilyvyysaika voidaan määritellä ajaksi, jonka olennaiset suoritusominaisuudet säilyvät tietyissä käsittelyolosuhteissa (33). Tämän kliinisiä reagensseja koskevan vaatimuksen täyttämiseksi tehtiin nopeutettu säilyvyystestitutkimus kaupallisen tuotteen likimääräisen säilyvyysajan määrittämiseksi. DPH-HRP-entsyymikonjugaattia rasitettiin 37 °C:ssa 14 vuorokauden ajan, ja tänä aikana se tutkittiin tietyin väliajoin ja sen suorituskykyä verrattiin jäähdytettyyn, 4 °C:ssa säilytettyyn lääkeaine-entsyymikonjugaattiin. Annos-vastekäyrä ajettiin 10, 50 ja 100 ng/ml:n kalibrointitasoilla synteettisessä virtsassa 14 päivän aikana. Määrityksen todettiin osoittavan lähes identtistä annos-vastetta koko 2 viikon kiihdytysaikaisen tutkimuksen ajan. Tämä 14 päivän kiihdytetyn ajan testi vastaa vähintään 18 kuukauden reaaliaikaista stabiilisuutta 4 °C:ssa (33). Tiedot on esitetty kuvassa 4.
Kiihdytetty stabiilisuustutkimus.
Kiihdytetty stabiilisuustutkimus.
Autenttiset näytteet
Määrityksen validoimiseksi virtsanäytteet otettiin eri ajankohtina viikon aikana viideltä vapaaehtoiselta, jotka ovat säännöllisiä difenhydramiinin terapeuttisia käyttäjiä yleisten allergiaoireiden vuoksi. Kaikkia viittä vapaaehtoista pyydettiin täyttämään kyselylomake, jossa ilmoitettiin kaikki heidän käyttämänsä lääkkeet, ja todettiin, että muita lääkkeitä ei ollut lueteltu. Kaksikymmentä näytettä kerättiin ja seulottiin ensin ELISA:lla ja varmistettiin sitten LC-MS-MS:llä. Kaikki virtsanäytteet laimennettiin 1:20 100 mM fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (pH 7,0) ennen ELISA-testin suorittamista. Kuusi näytettä osoittautui negatiiviseksi molemmilla menetelmillä, kun taas 14 näytettä oli positiivisia ELISA:lla, joista yhden näytteen negatiivisuus vahvistettiin LC-MS-MS:llä. Tämä saattoi johtua siitä, että kyseisessä näytteessä LC-MS-MS:llä todettu DPH:n määrä oli lähellä raja-arvoa 50 ng/ml. Positiivisten virtsanäytteiden DPH-pitoisuuden todettiin olevan 60-700 ng/ml. Kymmenen kontrollivirtsanäytettä valmistettiin myös lisäämällä synteettiseen negatiiviseen virtsaan matalia ja korkeita positiivisia difenhydramiinipitoisuuksia, ja ne analysoitiin edelleen määrityksessä. Tulokset olivat kaikki positiivisia ELISA-testissä ja korreloivat niiden LC-MS-MS-varmistustietojen kanssa.
Post mortem -näytteitä käytettiin verimäärityksen validointiin. Kaksikymmentä post mortem -verinäytettä saatiin LA County Coronerin laboratoriosta. Kaikki verinäytteet laimennettiin 1:10 100 mM fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella (pH 7,0) ennen analysointia. Kaikki 20 näytettä osoittautuivat ELISA-testissä positiivisiksi, ja niitä verrattiin niiden GC-MS-vahvistustietoihin, jotka nekin toimitti kuolinsyyntutkijan laboratorio ja jotka osoittivat, että ne sisälsivät DPH:n pitoisuudet vaihtelivat laajasti < 100 ja 870 ng/ml välillä. Vaikka yksi näytteistä vahvistettiin alle GC-MS:n määritysrajan (100 ng/ml), DPH tunnistettiin silti ELISA-menetelmällä. Tämän tutkimuksen tavoitteena oli validoida ELISA-menetelmä tunnetulla varmistusmenetelmällä eikä pyrkiä tulkitsemaan pitoisuuksia. Tämän tutkimuksen johtopäätös on, että ELISA-määrityksellä voidaan havaita terapeuttiset DPH-pitoisuudet sekä paljon korkeammat kuolemanjälkeiset pitoisuudet, minkä vuoksi sitä voitaisiin helposti käyttää rattijuopumuksen seulontatarkoituksiin sekä kuolemaan johtaneissa tapauksissa.
Johtopäätökset
DPH on reseptivapaasti myytävä lääkeaine, joka on yhdistetty lukuisiin rattijuopumusonnettomuuksiin sekä kuolemaan johtaneisiin tapauksiin. Niinpä ELISA-seulonta olisi hyödyllinen määritettäessä reseptivapaiden lääkkeiden, kuten antihistamiinien, esiintymistä näytteissä, jotka on saatu ajamiseen liittyvissä tilanteissa. Tässä asiakirjassa kuvataan erittäin herkän ja spesifisen ELISA-seulontamenetelmän kehittämistä difenhydramiinille sekä virtsa- että verimatriisissa tarkkuudella <10 %. Kirjoittajien tietojen mukaan tämä on ensimmäinen immunomääritysmenetelmä, joka on kehitetty DPH:n osoittamiseksi ihmisen kehon nesteistä. Menetelmä noudattaa suositeltuja suuntaviivoja, joiden mukaan DUID-tapausten raja-arvo on 50 ng/ml virtsassa ja 25 ng/ml veressä. Menetelmän pätevyys varmistettiin myös aidoilla virtsa- ja verinäytteillä, ja ELISA-menetelmän tiedot korreloivat LC-MS-MS- ja GC-MS-vahvistustulosten kanssa. Vaikka osa analysoiduista näytteistä oli post mortem -tapauksista, niistä saadut tulokset yhdessä määrityksen alhaisen LOD-arvon kanssa osoittavat selvästi määrityksen soveltuvuuden tienvarsitapauksiin, joissa DPH:ta voidaan havaita pienempiä määriä. Ristireaktiivisuutta havaittiin jonkin verran tiettyjen trisyklisten yhdisteiden kanssa, jotka ovat rakenteellisesti samankaltaisia kuin DPH; tällaisista yhdisteistä johtuvat väärät positiiviset tulokset voidaan kuitenkin poistaa varmistusvaiheessa. Lisätutkimuksia on tehtävä ristireaktiivisuusongelmien poistamiseksi trisyklisten yhdisteiden kanssa ja ristireaktiivisuuden parantamiseksi samankaltaisten antihistamiinien kanssa.
Kiitokset
Tätä työtä on tuettu Immunalysis Corporationin rahoituksella. Haluamme kiittää tohtori James Soaresia ja Michael Vincentiä oivaltavista keskusteluista tämän käsikirjoituksen valmistelun aikana, neiti Cynthia Coulteria virtsanäytteiden LC-MS-MS-analyysistä ja herra Dan Andersonia LA County Coronerin laboratoriossa positiivisten verinäytteiden toimittamisesta. Haluamme myös kiittää kaikkia vapaaehtoisia, jotka toimittivat virtsanäytteitä.
. ,
,
8th ed.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
O’Hanlon
.F.
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
G.D.
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
pg.
,
,
Jr.
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
Jr.
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
,
K.
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
,
,
,
,
,
,
,
Jr.
.
,
,
, vol.
(pg.
–
)
,
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
. ,
,
, vol.
8th ed
(pg.
–
)
. ,
,
, vol.
8th ed
(pg.
–
)
,
.
,
,
, vol.
(s.
–
)
.