S. I. MaintinguerI,*; I. K. SakamotoII; M. A. T. AdornoII; M. B. A. VarescheII,*
ABSTRACT
Teollisessa aktiivilietelaitoksessa esiintyvät mikrobiyhteisöt voivat vaikuttaa osaltaan denitrifikaatioprosessiin, mutta denitrifioivissa reaktoreissa esiintyviä mikro-organismeja koskevia tietoja on edelleen niukasti. Epäorgaanisten typpiyhdisteiden poistaminen voidaan toteuttaa lisäämällä hiilen lähteitä denitrifikaation biologiseen prosessiin. Etanoli on taloudellisesti kannattava vaihtoehto hiililähteeksi trooppisissa maissa, kuten Brasiliassa, jossa sitä tuotetaan laajamittaisesti sokeriruo’osta. Tässä asiakirjassa raportoidaan aktiivilietteen menestyksekkäästä käytöstä nitraatin ja etanolin kanssa anaerobisessa panosreaktorissa. Toiminta kesti 61,5 tuntia, ja nitraatin kokonaiskulutus oli 42,5 tuntia, nitriitin muodostuminen (2,0 mg/l) ja etanolin kulutus (830,0 mg/l) 23,5 tuntia. Denitrifioivien solujen lukumäärät todennäköisimmän lukumäärän mukaan olivat toiminnan alussa pienemmät kuin lopussa, mikä vahvistaa aktiivilietteestä saadun inokulumin kyvyn denitrifikaatioprosessiin. Solulukujen perusteella näytteistä tunnistettiin Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. ja viljelemättömät bakteerit. Näin ollen nämä lajit voivat osallistua nitraatin pelkistämiseen ja etanolin kulutukseen panosreaktorissa.
Avainsanat: Aktiivilietesysteemi; Acidovorax; Acinetobacter; Nitraatti; Etanoli.
TIIVISTELMÄ
Denitrifikaatioon kykenevät mikro-organismit ovat laajalti levinneet luonnossa: maaperässä, sedimentissä, makeassa vedessä, meressä ja jätevedenpuhdistusjärjestelmissä (Park & Yoo, 2009).
Monissa kotitalouksien ja teollisuuden jätevedenpuhdistamoiden inokulaatioissa voi olla denitrifioivia bakteereja, pääasiassa aktiivilietesysteemeissä (Liu et al., 2006; Daniel et al., 2009), joissa biologinen typenpoisto tapahtuu denitrifikaation edistämiseksi eli heterotrofisissa anoksisissa olosuhteissa orgaaniset hiililähteet toimivat elektroninluovuttajina ja pelkistävät nitraatin typpikaasuksi (Canto et al., 2008). Orgaanisen hiilen ja energialähteiden läsnäolo on välttämätöntä heterotrofiselle denitrifikaatiolle (Nava et al., 2010).
Vähemmistö denitrifioivista bakteereista kuuluu Proteobacteria-heimoon, johon kuuluvat muun muassa Acidovorax, Comamonas ja Acinetobacter. Tällaisia bakteereja voi esiintyä jätteenkäsittelyssä, erityisesti aktiivilietesysteemeissä, jotka pystyvät muodostamaan molekyylityppeä nitraatista ja ulkoisesta hiililähteestä, kuten etanolista. Täydellistä denitrifikaatiota eli nitraatin muuttumista typpikaasuksi välittävät bakteerilajit, jotka normaalisti käyttävät ilman happea energianlähteenä (aerobinen hengitys), mutta niillä on myös kyky käyttää nitraattia ja nitriittiä hapen sijasta (anoksinen tila). Näin ollen nämä bakteerit voivat kasvaa aerobisesti ilman nitraattia tai anoksisissa olosuhteissa nitraatin läsnä ollessa. Nitraatin muuntaminen molekyylitypeksi tunnetaan myös nimellä anoksinen hengitys (Park & Yoo, 2009).
Käytössä on käytetty monenlaisia orgaanisia yhdisteitä, kuten metanolia, etanolia, glukoosia, asetaattia, aspartaattia tai muurahaishappoa ja aromaattisia yhdisteitä (Queiroz et al., 2011). Suurin osa juomaveden denitrifikaatiota koskevista julkaistuista tutkimuksista koskee kuitenkin metanolin, etanolin ja etikkahapon käyttöä (Park & Yoo, 2009). Etanoli (Daniel et al., 2009), glukoosi ja asetaatti ovat joitakin denitrifikaatiossa menestyksekkäästi käytettyjä ulkoisia elektroninluovuttajia. Erityisesti Brasiliassa etanoli on käyttökelpoinen vaihtoehto (Gavazza dos Santos et al., 2004). Etanolia on tuotettu Brasiliassa laajamittaisesti vuodesta 1975 lähtien kansallisen alkoholiohjelman (19751985) myötä. Brasilia tuottaa lähes 2,6 x 108 tonnia sokeriruokoa, joka jalostetaan 324 sokeritehtaassa sokerin ja etanolin tuottamiseksi (Borrero et al., 2003). Sitä tuotetaan runsaasti sokeriruo’osta, ja se maksaa yleensä vähemmän kuin muut kätevät hiililähteet. Lisäelektronien luovuttajalähteiden tarve eksogeenista prosessia varten lisää kuitenkin käyttökustannuksia, mikä on mahdollisesti haitta innovatiivisten anaerobisiin prosesseihin perustuvien tekniikoiden käytölle (Gavazza dos Santos et al., 2004).
Bakteerien energiareaktiota kuvaavat stoikiometriset suhteet (Park & Yoo, 2009) kirjoitetaan seuraavasti, kun hiililähteenä käytetään etanolia:
0,69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.14 C5H7NO2 +0,43 N2 + 0,67 CO2 + 2,07 H2O
Vaikka tämä yhtälö paljastaa nitraattidissimilaatioon tarvittavan etanolin stoikiometrisen määrän, tarvitaan lisäetanolia hapenpoistoon ja solusynteesiin. Käytännössä 25-30 % tarvittavasta etanolista käytetään bakteerisolujen synteesiin. Kun liuennut happi on läsnä, etanolitarve on vastaavasti suurempi. Siksi substraatin ja nitraatin painosuhteen (C:N03) yleinen työarvo on lähes 3 (Park & Yoo, 2009).
Panosreaktoreista ja denitrifikaatioprosessista on vain muutamia viitteitä. Näitä kokoonpanoja voidaan käyttää ravinnevaatimusten tutkimiseen (Maintinguer et al., 2008). Kompleksisilla hiilihydraateilla tapahtuvaa denitrifikaatioprosessia arvioidaan panosreaktoreissa, koska näissä järjestelmissä esiintyvä hiukkasmainen orgaaninen aines voi vaikeuttaa toimintaa muissa kokoonpanoissa, kuten tärkkelyksen kanssa (Iamamoto, 2006). Lisäksi biomassa säilyy panosreaktorissa kaikkina toimintajaksoina verrattuna jatkuvavirtausreaktoreihin. Nämä seikat voivat osaltaan vaikuttaa panosreaktorissa todennettuun nitraatin kokonaiskulutukseen (Etchebehere et al., 2001; Gavazza dos Santos et al., 2004).
Nitraatinpoistoa aktiivilietteen inokulaatiolla on tutkittu erityisesti lauhkean ilmaston maissa. Trooppisista maista, kuten Brasiliasta, on vain vähän raportteja tutkimuksista, jotka koskevat nitraatinpoistoa ja molekyylibiologiaa aktiivilietteen inokulumin avulla. Tässä mielessä tutkimuksemme ensimmäinen tavoite oli arvioida denitrifikaatioprosessia trooppisen ilmaston aktiivilietteen inokulaatiolla. Tutkimuksemme toisena tavoitteena oli suorittaa inokulumin mikrobiologinen karakterisointi, jonka tavoitteena oli tunnistaa mahdolliset organismit, jotka osallistuvat erityisesti denitrifikaatioprosessiin.
Tässä työssä tutkittiin denitrifikaation mikrobien monimuotoisuutta panosreaktorissa, johon syötetään etanolia ja nitraattia, käyttäen molekyylibiologian tekniikoita ja perinteisiä mikrobiologian menetelmiä.
MATERIAALI JA MENETELMÄT
Batch-reaktori
Koe suoritettiin Volkswagen São Carlosin (São Carlos SP – Brasilia) jätevedenpuhdistamon aktiivilietelaitoksen lietteellä.
Panosreaktorit valmistettiin kolmena kappaleena 2 L:n Duran®-pulloissa, joista 1 L oli reaktioainetta, 10 % (v/v) inokulaattia (100 ml/l).
Reaktorit altistettiin N2-ilmakehälle (99,99 %) 20 minuutiksi liuosten jakamisen jälkeen. Tämän jälkeen ne suljettiin butyylikumitulpilla, käärittiin ja säilytettiin 25 ºC ± 1 ºC:ssa sekoittaen 120 rpm:n kierrosnopeudella 61,5 tunnin ajan.
Fysikaalis-kemiallinen ja kromatografinen analyysi
Haihtuvien kiintoaineiden kokonaismäärä (TVS) ja nitraatin kulutus määritettiin APHA:n (APHA, 2005) ohjeiden mukaisesti spektrofotometrisesti. Nitriittimääritys tehtiin virtausinjektiolla (FIA APHA, 2005). Haihtuvat rasvahapot ja alkoholit määritettiin kaasukromatografisesti Shimadzu GC-2010 -laitteessa, joka oli varustettu liekki-ionisaatioilmaisimella, automaattisella näytteenottimella headspace COMBI-PAL – AOC malli 5000 ja HP-INNOWAX-kolonnilla (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm kalvonpaksuus) Maintinguerin ym. mukaan, 2008).
Denitrifioivien bakteerien kvantitatiivinen määritys
Denitrifioivien bakteerien todennäköisin lukumäärä (Most probable Number, MPN) suoritettiin viisinkertaisella laimennoksella panosreaktorin toiminnan alussa ja lopussa Tiedjen (1982) mukaisesti nestemäisille näytteille mukautettuna. Solulaskenta MPN-menetelmällä tehtiin 15 päivän inkubaation jälkeen APHA:n (2005) mukaisesti. MPN-määrityksissä käytetyn kasvatusalustan koostumus ja, nitraatti- ja etanolipitoisuudet olivat samanlaiset kuin panosreaktorikäytössä, kuten aiemmin mainittiin.
Molekyylibiologia
Näytteet 16S rRNA:n analysoimiseksi saatiin panosreaktoreiden denitrifioivien bakteerien suurimmista positiivisista laimennoslaskennoista (MPN) testin lopussa.
Näytteiden genominen kokonais-DNA hankittiin sen jälkeen, kun solut oli lysoitu lasihelmillä (Sigma) ja fenoli-kloroformiuutto oli suoritettu Griffithsin ym. (2000) aiemmin kuvaamalla tavalla muutettuna.
Monistaminen polymeraasiketjureaktiolla (PCR) suoritettiin 16S rRNA -geenin bakteerialueen alukesarjalla, 27 eteenpäin (5′-AGAGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′) ja 1100 taaksepäin (5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3′) (Lane, 1991). PCR (Thermo cycler Eppendorf AG – Hamburg 22,331) -monistus suoritettiin denaturoimalla aluksi 94 ºC:ssa 5 minuutin ajan, minkä jälkeen tehtiin 30 sykliä, joissa denaturoitiin 94 ºC:ssa 45 sekuntia, hehkutettiin 55 ºC:ssa 45 sekuntia, pidennettiin 72 ºC:ssa 1,45 minuuttia ja pidennettiin 72 ºC:ssa 7 minuuttia ja jäähdytettiin 4 ºC:ssa.
Näytteet PCR-tuotteista (polymeraasiketjureaktio) (16S rRNA) kloonattiin plasmidivektoriin pGEM (Promega Easy Vector System I) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kloonit valittiin satunnaisesti ja monistettiin PCR:llä. Nukleotidisekvensointi suoritettiin automatisoidulla ABI 310 PRISM sekvenssilaitteella (Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) valmistajan ohjeiden mukaisesti käyttäen M13 forward-alkuria (50-GTAAAA CGA CGG CCA G-30) (Messing, 1983). PCR (Thermo cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) -monistus suoritettiin denaturoimalla aluksi 94 ºC:ssa 2 minuutin ajan, minkä jälkeen tehtiin 25 sykliä, joissa denaturoitiin 94 ºC:ssa 1 minuutti, hehkutettiin 55 ºC:ssa 1 minuutti, pidennettiin 72 ºC:ssa 1 minuutti ja lopuksi pidennettiin 72 ºC:ssa 7 minuuttia ja jäähdytettiin 4 ºC:ssa.
Nukleotidisekvenssit käsiteltiin ja ne linjattiin Seqman-ohjelmalla (Lasergene DNAstar -paketti) vektorin signaalien ja huonolaatuisten emästen poistamiseksi. Linjatut sekvenssit määritettiin NCBI:n verkkosivuilla olevalla BLAST-hakuohjelmalla, jota verrattiin Genbank-tietokannassa (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) ja Ribosomal Data Base Project -tietokannassa (http://rdp.cme.smu.edu) edustettuina oleviin 16S rRNA-geenin organismin sekvensseihin. Fylogeneettinen puu rakennettiin Neighbor-Joining-menetelmällä (Saitou & Nei, 1987) käyttäen MEGA-ohjelman versiota 4.1 (Kumar et al., 2008). Bootstrap-resampling-analyysi 1000 toistolle suoritettiin puun topologioiden luotettavuuden arvioimiseksi. Aspergillus nigerin (FJ828924.1) tunnetut sekvenssit lisättiin ja sitä käytettiin ulkoryhmänä.
TULOKSET JA KESKUSTELU
Nitraatti oli kulutettu kokonaan 42,5 tunnin käytön jälkeen (kuva 1). Nitriitin muodostuminen väheni (2,0 mg/l 18,5 tunnin kohdalla) ja tapahtui 23,5 tunnin käytön aikana. 1,06 g etanolia/l (36 % kulutus) havaittiin 13,5 tunnin käytön jälkeen, kun alkupitoisuus oli 1 650 mg/l. Etanolin kulutus kokeen lopussa oli 54 % (0,77 g/l 61,5 tunnissa). Nämä tulokset olivat lähes samat kuin Gusmão et al. (2006). Kirjoittajat (op.cit.) havaitsivat 98,9 % nitraatin kulutuksesta 14 tunnin käytön aikana puhdistetuilla soluilla, jotka olivat peräisin rakeisesta lietteestä, joka oli peräisin ylösvirtauksellisesta anaerobisesta lietepeitteestä (UASB), jossa käsiteltiin siipikarjan teurastamosta (DAKAR-Tietê SP Brasilia) peräisin olevaa jätevettä, ja jossa hiililähteinä olivat nitraatti (350 N-NO3 mg/L), etanoli (377 mg/L) ja bentseeni (10 mg/L).
Metanolia (197,78 mg/L) ja n-butanolia (23,50 mg/L) havaittiin kokeen alussa. Näitä alkoholeja (metanoli ja n-butanoli) esiintyi mahdollisesti inokulaatiossa. Alkoholien pitoisuuksissa oli vain vähän vaihtelua kokeen loppuun asti, mikä osoittaa, että niitä ei kulutettu tässä denitrifikaatio-olosuhteessa (kuva 2).
Enimmillään etikkahappoa muodostui 16,7 mg/L 61,5 tunnin käytön aikana. STV:n arvot panosreaktorin toiminnan alussa olivat 5,14 g/l ja lopussa 11,40 g/l, mikä osoittaa biomassan lisääntyneen 122 %. Nämä tulokset osoittivat, että panosreaktorille asetetut käyttöolosuhteet hyödyttivät bakteerikonsortion kehittymistä ja pysyvyyttä denitrifikaatio-olosuhteissa.
Tässä tutkimuksessa havaittiin denitrifikaatioprosessi, jota myös muut kirjoittajat ovat kuvanneet käyttäen erilaisia reaktorikokoonpanoja.
Callado & Foresti (2001) käytti anaerobisia reaktoreita, joihin syötettiin synteettistä substraattia, joka simuloi kotitalousjätevesiä, poistaakseen suurimman osan hiilipitoisesta aineksesta ja edistääkseen substraatin nitrifikaatiota, denitrifikaatiota ja biologista fosfaatinpoistoa samassa eräkierrossa peräkkäisessä anaerobisessa/aerobisessa/anaerobisessa erärakenteisessa erärakennereaktorissa. Järjestelmää käytettiin 41 päivän ajan 84:llä 12 tunnin jaksolla 28 ± 1 ºC:n lämpötilassa. Kirjoittajat (op.cit,) havaitsivat, että denitrifikaatio tapahtui vuorotellen aerobisissa ja anoksisissa olosuhteissa reaktiovaiheessa. Molemmat prosessit tapahtuivat vain, kun natriumasetaattia (500 mg/l) lisättiin anoksisen vaiheen alussa.
Etchebehere et al. (2001) testasivat asetaattia (40 mmol/L) ja glukoosia (13 mmol/L) denitrifikaation hiililähteinä anaerobisessa panosreaktorissa kaliumnitraatin (20 mmol/L) kanssa kolmella erilaisella inokulaatiolla: lietettä anoksisesta reaktorista (laboratoriomittakaavassa), jolla poistettiin hiiltä ja typpeä saniteettiterminaalin kaatopaikan suotovedestä; lietettä ammattikorkeakoulun metanogeenisesta reaktorista, jossa käsiteltiin maltaita, ja lietettä anoksisesta reaktorista, johon syötettiin asetaattia ja nitraattia. Nitraatti kului kokonaan kolmesta testatusta lietenäytteestä, kuten tässä tutkimuksessa havaittiin. Kirjoittajat (op. cit.) päättelivät, että asetaatti on parempi hiililähde kuin glukoosi.
Gavazza dos Santos et al. (2004) tutkivat denitrifikaatioprosessia, joka suoritettiin panosreaktoreissa, joita ruokittiin synteettisellä jätevedellä, joka simuloi kotitalouksien jätevedenpuhdistamoiden nitrifioidut jätevedet, käyttäen kolmea elektroninluovuttajalähdettä: metanolia (53,3 mg/L), etanolia (38,3 mg/L) ja metaania (synteettisen jäteveden ohella). Kirjoittajat (op.cit.) havaitsivat, että tehokkain elektroninluovuttaja oli etanoli, joka poisti nitriitin ja nitraatin kokonaan, kuten tässä työssä havaittiin.
Iamamoto (2006) sai aikaan yli 84 %:n typenpoiston sekventiaalisessa panosreaktorissa, jota syötettiin tärkkelyksellä ja ammoniumilla vuorotellen anoksisissa ja aerobisissa olosuhteissa (2h/2h syklit) ja 2 mg O2/L seuraavilla pitoisuuksilla: 125 mg N-NH4/L ja 0,95 g tärkkelystä/L, 250 mg N-NH4/L ja 1,9 g tärkkelystä/L, 500 mg N-NH4/L ja 3.8 g tärkkelystä/l, jossa oli aktiivilietelaitoksen (Flores da Cunha Rio Claro SP Brasilia) aktiivilietelaitoksesta peräisin oleva inokulaatio. Hiilen lähteenä testattiin myös etanolia (1 500 mg/L) yhdessä 500 mg NH4-N/L:n kanssa. Kirjoittajat (op.cit.) havaitsivat, että nitriitin ja nitraatin poistuminen oli täydellistä (100 %), kuten tässä tutkimuksessa havaittiin, mikä osoittaa etanolin käyttökelpoisuuden denitrifikaatioprosessissa.
Denitrifioivien solujen määrä MPN:llä mitattuna panosreaktorin toiminnan alussa oli alhaisempi (1,1 x 1010 MPN/mL) kuin toiminnan lopussa (1,2 x 1019 MPN/mL) (kuva 3). Nämä tulokset ovat korkeampia kuin kirjallisuudessa esitetyt, jäljempänä kuvatut tulokset.
Etchebehere et al. (2001) laskivat denitrifioivia soluja todennäköisimmän lukumäärän (MPN) mukaan perusaineessa, jota oli täydennetty hiivauutteella (0,5 g/l), kaliumasetaatilla (1,84 g/l) ja kaliumnitraatilla (0,72 g/l), ja saivat tulokseksi 9,6 x 106 MPN/ml lietteellä, joka oli peräisin suotoveden käsittelyjärjestelmän anoksisesta reaktorista. Callado ja Foresti (2001) käyttivät natriumasetaattia hiililähteenä sekventiaalisessa anaerobisessa/ aerobisessa/anaerobisessa panosreaktorissa ja havaitsivat enemmän MPN denitrifioivia bakteereja toiminnan alussa (2,5 x 106 MPN/ml) kuin lopussa (3,5 x 105 MPN/ml). Kirjoittajat (op.cit.) päättelivät, että tämä lasku ei vaikuttanut denitrifikaatioprosessiin.
Iamamoto (2006) sai saman suuruusluokan denitrifioivien bakteerien MPN:n toiminnan lopussa sekventiaalisessa panosreaktorissa, jossa käytettiin 250 mg N-NO3/L (3,9 x 106 MPN/ml) ja 500 mg N-NO3/L (1.1 x 106 MPN/ml), kun molempiin lisättiin tärkkelystä (1 900 mg/l) hiilen lähteenä ja inokulaatiota jätevedenpuhdistamon (Rio Claro SP – Brasilia) aktiivilietteestä.
Denitrifioivia bakteereja suosivat anoksisessa reaktorissa vallinneet ravitsemusolosuhteet. Tämä seikka vahvisti aktiivilietteestä peräisin olevan inokulumin kyvyn denitrifikaatioprosessiin.
Analysoidusta näytteestä saatiin 50 kloonia mikrobikonsortion 16S rRNA -geenifragmenttien kloonausta ja sekvensointia varten. Kloonit, joiden arvot olivat alle 180 nukleotidia, jätettiin kuitenkin sisällyttämättä fylogeneettiseen analyysiin, koska niitä ei voitu verrata jäljempänä kuvattuun tietokantaan. Kloonauksesta ja sekvensoinnista saadut sekvenssit saatiin MPN:n suurimman laimennoksen positiivisesta näytteestä (10-18) (taulukko 1).
Acinetobacter sp. tunnistettiin samankaltaisina: 98 % (kloonit 1, 8, 13, 15, 33, 43, 45, 52, 54, 62, 67, 83 ja 2, 4, 18, 20, 23 ja 27) ja 99 % (kloonit 6, 15, 16, 37 ja 38). Se on gramnegatiivinen, liikkumaton, oksidaasinegatiivinen, ei-fermentatiivinen, pareittain esiintyvä bakteeri, joka kuuluu Proteobakteerien heimoon ja Moraxellaceae-sukuun. Se on tärkeä mikro-organismi maaperässä, jossa se voi edistää esimerkiksi aromaattisten yhdisteiden mineralisaatiota (Geng et al., 2006). Wang et al. (2007) eristivät Acinetobacter-kantoja näytteestä, joka oli peräisin aktiivilietesysteemistä (Jizhuangzi Tianjin – Kiina). Tämä kanta kykeni biologisesti hajottamaan fenolia (1,1 g/l) vapaiden ja immobilisoitujen solujen avulla. Geng et al. (2006) eristivät fenolia hajottavia bakteereja näytteestä, joka oli peräisin aktiivilietekäsittelyjärjestelmästä (Singapore). Biokemialliset testit osoittivat, että nämä mikro-organismit voivat kasvaa etanolin, glukoosin, sakkaroosin ja aromaattisten yhdisteiden, kuten tolueenin, fenolin ja bentsoaatin, läsnä ollessa. Se kuvattiin uudeksi lajiksi, Acinetobacter EDP3:ksi. Kirjoittajat (op.cit.) päättelivät, että tätä lajia voidaan käyttää fenolisten yhdisteiden poistamiseen tai fenolin in situ -bioremediaatioon maaperässä. Cai et al. (2009) tunnistivat 58 resistenttiä bakteeria arseenin saastuttamasta maaperästä. Acinetobacter-, Agrobacterium-, Arthrobacter-, Comamonas-, Rhodococcus-, Pseudomonas- ja Stenotrophomonas-kannat tunnistettiin korkeissa pitoisuuksissa (20 mM Ar/L). Tässä työssä tunnistettujen Acinetobacter sp. -bakteerien kasvu johtui asetetuista toimintaolosuhteista, ja ne saattoivat edistää denitrifikaatiota.
Kloonit 24 ja 26 olivat samankaltaisia kuin Comamonas sp., ja niiden samankaltaisuus oli 98 % ja 97 %. Comamonas on gramnegatiivinen bakteeri, joka kuuluu Proteobacteria-sukuun ja Comamonadaceae-sukuun. Etchebehere et al. (2001) eristivät gramnegatiivisia denitrifioivia bakteereja kaatopaikan suotoveden käsittelyyn käytetystä anoksisesta reaktorista Montevideossa (Uruguay). Eristetyt lajit olivat samankaltaisia Comamonas terrigenan kanssa. Tätä mikro-organismia pidettiin kuitenkin uutena lajina, jonka nimi oli Comamonas nitrativorans. Se kuvattiin gramnegatiiviseksi bakteeriksi, jonka polaarinen lippulaite on liikkuva, aerobinen ja kemoorganotrofinen. Tämä laji kasvoi etanolissa, asetaatissa ja butyraatissa, nitraatissa, nitriitissä ja voi pelkistää nitraattia N2:ksi.
Tässä tutkimuksessa tunnistetut Comamonas-lajit esiintyivät siis aktiivilietteen inokulaatiossa, ja ne saattoivat osaltaan vaikuttaa kokeissa tapahtuneeseen denitrifikaatioon.
Kloonit 25, 28, 34, 36, 42 ja 65 olivat samankaltaisia kuin Acidovorax sp., ja niiden samankaltaisuus oli 99 % ja 97 % (taulukko 1). Acidovorax sp. kuuluu Proteobacteria Phylum -heimoon; sitä esiintyy helposti aktiivilietesysteemeissä. Monet Acidovorax-lajit toimivat mikrobiologisten käsittelyprosessien säätelymikro-organismeina aktiivilietesysteemeissä. Useita Acidovorax-lajeja käytetään muovin biohajoamisessa ja muiden orgaanisten epäpuhtauksien, kuten nitrofenolien, nitrobentseenin ja polykloorattujen bifenyylien, poistamisessa denitrifikaation avulla (www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html). Khan et al. (2002) eristivät denitrifioivia bakteerilajeja, jotka hajottivat PHBV:tä (poly-3-hydroksibutyraatti-co-3-hydroksivaleraatti) kolmesta aktiivilietesysteemistä, joita käytettiin kunnallisten jätevesien käsittelyyn (Nagoya, Osaka ja Toyohashi – Japani). Analysoidut 37 kloonia olivat samankaltaisia betaproteobakteerien luokkaan kuuluvien organismien kanssa. Useimmat kloonit olivat samankaltaisia Acidovorax-lajien kanssa, mikä vahvistaa, että tämä laji osallistui PHBV:n hajottamiseen denitrifioivissa olosuhteissa. Gentile et al. (2007) eristivät Acidovoraxin, Delftia acidovoransin, Pseudomonasin, Chryseobacteriumin ja Achromobacterin kanssa samankaltaisia lajeja denitrifioivasta reaktorista, jota käytettiin hiililähteinä etanolia (40,0 g/l) ja maitohappoa (40,0 g/l); he testasivat elektroninluovuttajia erikseen, ja typen lähteenä käytettiin nitraattia (1,9 g NaNO3/l; 2,3 g KNO3/l). Kirjoittajat (op. cit.) päättelivät, että täydellisen nitraatin pelkistymisen N2:ksi suorittivat Acidovorax-lajit, kun taas Achromobacter sp. ja Delftia acidovorans vastasivat epätäydellisestä nitraatin denitrifikaatiosta nitriitiksi. Acidovorax-lajeja esiintyi siis tässä tutkimuksessa analysoiduissa näytteissä, ja ne saattoivat osallistua panosreaktorissa tapahtuneeseen denitrifikaatioon.
Rhodocyclaceae-sukuun kuuluvia viljeltyjä bakteerikantoja tunnistettiin 98 %:n samankaltaisuudella (klooni 9 – AY945917.1 ja kloonit 46, 84 AY945905), kuten taulukosta 1 ilmenee. Rhodocyclaceae-suvun jäsenet ovat gramnegatiivisia bakteereja, jotka kuuluvat betaproteobakteerien luokkaan. Ne ovat denitrifioivia aerobisia sauvoja, joilla on monipuolinen aineenvaihduntakapasiteetti. Useimmat lajit elävät vesiympäristöissä ja oligotrofisissa maaperäolosuhteissa. Niitä esiintyy paljon jätevesissä, ja niillä on tärkeä rooli tällaisten kohteiden biologisessa puhdistuskäsittelyssä (http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae). Liu et al. (2006) syöttivät denitrifioivaan reaktoriin kinoliinia (40 mg/l), joka on myrkyllinen amiini, jota käytetään väriaineiden, torjunta-aineiden ja synteettisten polttoaineiden valmistuksessa, glukoosia (180 mg/l), nitraattia ja kaliumfosfaattia (C/N/P 150:30:1). Inokulaatio oli peräisin Industry Shanghai Coking & Chemical Factoryn (Wujing, Shanghai – Japani) jätevedenpuhdistusjärjestelmän toisesta laskeutusaltaasta. Kinoliinin poistuma oli 90,2 % tasaisen reaktorijakson (6 viikkoa) jälkeen. Molekyylibiologiset analyysit inokulumista ja denitrifioivasta reaktorista paljastivat molemmissa testeissä viljelemättömiä bakteereja, Thauera ja Azoarcus. Kirjoittajien mukaan Azoarcus- ja Thauera-bakteereihin kuuluvien kloonien prosenttiosuudet olivat 74 % denitrifioivassa reaktorissa ja 4 % inokulaatiossa. Mikro-organismien tuntemus ympäristönäytteistä on riippuvainen laboratorio-olosuhteista, joissa käytetään puhdasviljelmiä (Pace, 1997). Kuitenkin alle 1 % eri ekosysteemeistä peräisin olevista bakteereista tunnetaan (Amann, 1995), tai noin 99 % ei ole tutkittu ja tunnistettu. Siksi tässä työssä odotimme saavamme samanlaisia sekvenssejä viljelemättömistä bakteereista.
Kokeen molekyylibiologisissa analyyseissä konsensus Bacteria domain -alukoilla saadut fylogeneettiset puut on esitetty kuvassa 4.
Mikro-organismien eri ryhmien väliset samankaltaisuuskertoimet olivat 97-99 %, ja ne viittasivat siihen, että kyseessä olivat fylogeneettisesti sukua keskenään olevat lajit, jotka perustuivat 16S rRNA -geenin osittaisarvosekvensseihin. Lajien tunnetut sekvenssit olivat NCBI-tietokannasta, jossa Aspergillus niger (FJ828924.1) oli ulkoryhmän sekvenssi.
Tässä tutkimuksessa tunnistetut Acidovorax-, Comamonas- ja Acinetobacter-lajit esiintyivät siis Volkswagen São Carlos Motorsin aktivoidun lietteen järjestelmässä, ja ne saattoivat osallistua nitraatin pelkistämiseen ja etanolin kulutukseen.
Johtopäätökset
Aktiivilietesysteemistä peräisin olevan inokulumin potentiaali ja etanolin käyttö hiililähteenä denitrifikaatioprosessissa on osoitettu panosreaktorissa.
Tässä tutkimuksessa saadut denitrifioivien bakteerien MPN-arvot yhdistettynä nitraatin poistoa koskeviin tuloksiin osoittivat, että aktiivilietesysteemistä peräisin olevassa inokulmassa oli denitrifioivia bakteereja, joita asetetut ravitsemukselliset olosuhteet suosivat.
Identifioidut kloonit olivat fylogeneettiseltä luokitukseltaan kuuluvia Proteobacteria-fylobakteerien kantaryhmään, Alphaproteobacteria-luokkaan ja Gamaproteobakteerien luokkaan, jossa oli mukana myös Acidovorax-spesiferia, Acinetobacter sp., Comamonas sp. ja viljelemättömät bakteerit. Nämä bakteerit voisivat osallistua nitraatin pelkistämiseen ja etanolin kulutukseen anoksisessa panosreaktorissa.
LÄHTEET
Tekijät kiittävät FAPESP:ltä ja CNPq:ltä saamiaan apurahoja.
APHA:n, AWWA:n ja WEF:n standardimenetelmät veden ja jäteveden tutkimista varten. 22. painos, American Public Health Association, Washington, DC (2005).
Iamamoto, C. Y., Typen poisto sekvensoivassa panosreaktorissa, jossa on suspendoitunutta biomassaa käsiteltäessä korkean ammoniakkipitoisuuden jätevesiä. Väitöskirja, São Paulon yliopisto, Brasilia, Insinööritieteiden korkeakoulu, São Carlosin yliopisto, Brasilia (2006).
Messing, J., Uudet M13-vektorit kloonaukseen. Methods in Enzymology, 101 20-78 (1983).
Pace, N. R., A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science, 276, 734-740 (1997).