Kondensaattori – eri tyypit. Kontrasti mikroskoopissa
Edellisessä okulaaria käsittelevässä artikkelissa huomautin, että okulaari sijoitettiin tavallisesti siten, että sen etummainen polttotasotaso oli samansuuntainen ensisijaisen kuvatason (PIP) kanssa. PIP on konjugoitunut näytteen kanssa konjugoitujen tasojen kuvantamisjoukossa, ja siksi se on hyödyllinen mikroskooppisten näytteiden ominaisuuksien mittaamisessa.
Samalla tavalla kondensaattorin etutarkennustaso on konjugoitunut objektiivin takatarkennustason (mutta ei näytteen) kanssa valaistussäteiden sarjassa. Kondensaattori tarjoaa siis käytettävissä olevan paikan, jossa voimme muuttaa tai säätää kuvan kontrastia manipuloimalla valaisevia valonsäteitä. Nämä kaksi periaatetta johtuvat Köhlerin valaisumenetelmästä, jota käsiteltiin tämän sarjan 3. osassa.
Kondensaattorin tehtävä
Kondensaattori täyttää mikroskoopissa kaksi tehtävää. Se tuottaa tasaisesti valaistun valon alueen näkökenttään näytetasolle ja valaisee objektiivin aukon tasaisesti valolla, jonka kulma on riittävä mutta hallittavissa. Toiseksi, kuten edellä mainittiin, se tarjoaa keinon säätää kontrastia (Bradbury & Evennett, 1996). Kondensaattorin yksinkertaisin muoto on kovera peili, mutta se ei ole käyttökelpoinen objektiiveille, joiden NA on suurempi kuin noin 0,2. Jos mikroskoopissasi on peili ja etävalonlähde, peilin litteää puolta on käytettävä yhdessä minkä tahansa asennetun subage-kondensaattorin kanssa. Tämä johtuu siitä, että tarkalleen ottaen kondensaattorin pitäisi vastaanottaa samansuuntainen valaistus ja siten saada tämä valo tarkentumaan kondensaattorin takimmaiseen polttotasoon (jossa näyte sijaitsee).
Kondensaattorityypit
Laajimmin käytetty kondensaattorityyppi on Abbe-kondensaattori kirkkaankenttämikroskopiassa (kuva 1a, 1b). Se koostuu kahdesta tai kolmesta linssistä, ja ylempi lyhyen tarkennuksen linssi voidaan yleensä kääntää pois optiselta tieltä (1a) tai ruuvata irti (1b), jotta näkökenttä voidaan täyttää pienitehoisilla objektiiveilla. Tämä yksinkertainen valaisin riittää useimpiin mikroskopiatyyppeihin. Se suunniteltiin alun perin tuottamaan kapeita vinovalonsäteitä (tai ”lyijykyniä”) kondensaattorin etutason polttotasossa olevasta eksentrisesti sijoitetusta aukosta. Kuvassa 1c esitetään yksinkertainen kaksilinssinen Abbe-valaisin, joka on asennettu subage-laitteeseen, jota voitiin kääntää ja liikuttaa eksentrisesti vinovalaistuksen aikaansaamiseksi. Kuvassa 1d on pienitehoinen kondensaattori, joka on suunniteltu täyttämään kokonaan hyvin pienikokoisten objektiivien suuri näkökenttä.
Vaikka kondensaattorille saatetaankin ilmoittaa numeerinen aukko (usein 0,9 NA kuiville kondensaattoreille ja enintään 1,4 NA öljyimmersiotyypeille), nämä luvut eivät anna mitään viitteitä siitä, minkä NA:n osalta valaisevat säteet on korjattu sfäärisen aberraation suhteen. Monissa yksinkertaisissa kondensaattoreissa aksiaalisen valaistuksen kiinteä valokartio on harvoin korjattu sfäärisen aberraation osalta yli 0,45 NA:n. Laadukasta työskentelyä ja rakenteen erottelukyvyn rajoilla tapahtuvaa erottelua varten kondensaattorit on korjattava aberraatioiden suhteen. Täysin korjatut kondensaattorit, kuten objektiivitkin, sisältävät monia linssielementtejä, ja ne voidaan korjata lähes samassa määrin. Akromaattis-aplanaattinen kondensaattori (1e) on korjattu sekä sfäärisen että kromaattisen aberraation osalta, ja sitä olisi käytettävä korkealaatuisimpaan työhön ja värivalokuvaan. Aplanaattiset kondensaattorit on korjattu vain sfäärisen aberraation osalta.
Ns. yleiskondensaattorit (kuva 2) ovat monikäyttöisiä. Ne koostuvat pyörivästä kiekosta, jossa on erilaisia aukkokalvoja, suodattimia, patch-stoppeja, vaihelevyjä tai Wollastonin prismoja differentiaalista interferenssikontrastia (DIC) varten. Tämä järjestely mahdollistaa siirtymisen kontrastimenetelmästä toiseen kätevästi ja helposti. Tummapohjainen patch-stop toimii yleensä vain NA 0,5:een tai sen tuntumaan asti. Suurempien NA-arvojen objektiivien kanssa käytettäväksi on käytettävä erikoisrakenteista pimeämaakondensaattoria (kuva 3). Lisätietoja sen käytöstä ja muista kontrastinparannusmenetelmistä on Bradbury & Evennett (1996).
Kuva 2. Yleiskondensaattorit. Keskimmäisessä kuvassa yläkansi on poistettu, jolloin näkyviin tulee pyörivä kiekko, jossa sijaitsevat apertuurin faasirenkaat, DIC-prismat, pimeän maan laikkupysäyttimet, Rheinbergin kiekot ja Hoffmanin modulaatiosuodattimet. Useimmissa yleiskondensaattoreissa on apertuuri-iris kirkkaankenttätyöskentelyä varten, useita annuleita vaihekontrastia varten ja pimeämaapysäytin pienitehoista pimeämaata varten.
Kuva 3. Pimeän maan kondensaattorit. 3(a) Kuiva pimeämaalauhdutin. 3(b) & 3(c) Öljyyn upotetut pimeämaalauhduttimet. 3 d) Säädettävä öljyimmersio-tummapohjakondensaattori; tätä kondensaattoria voidaan säätää eri paksuisten diojen mukaan, jotta saadaan korkealaatuinen tummapohjakuva.
Välkevalo- ja heijastuneen valon mikroskooppi
Välkevalomikroskoopin järjestely vaatii erillisen kondensaattorin, koska valo ensin tiivistyy näytteeseen (jossa valo on vuorovaikutuksessa aineen kanssa) ja sen jälkeen kerätään objektiivilla kauempana optista akselia pitkin.
Tilanne heijastuneen valon mikroskoopissa on toinen. Tässä säteen kulkureitti taittuu näytteen akselin ympäri, jolloin valo heijastuu sen pinnasta. Objektiivi toimii omana kondensaattorinaan, ja heijastuneen valon mikroskoopin kohdistus on hyvin paljon yksinkertaisempi (ks. tämän sarjan osan 2 sädekuviot). Objektiivin takimmaiseen polttotasoon (etummaiseen polttotasoon, kun sitä käytetään kondensaattorina) on kuitenkin vaikea päästä käsiksi, joten käytetään lisäobjektiiveja, jotta saadaan aikaan asento, jossa kalvojen ja suodattimien kuva on konjugoitunut takimmaisen polttotason kanssa.
Tapahtumavalojärjestelmä on erittäin käyttökelpoinen fluoresenssimikroskopiassa lähinnä siksi, että näytteen valaiseminen on yksinkertaista, se on tehokkaampi (antaa kirkkaampia kuvia suurilla suurennoksilla) ja sen yhdistäminen muihin kontrastimenetelmiin läpäisevän valon avulla on sallittua. Kuvituskuva heijastetun valon mikroskopiaan tarkoitetusta epi-valaisimesta
Tässä epi-kondensaattorissa on kaksi erityyppistä heijastetun valon objektiivia, jotka on asennettu sen nokkakappaleeseen. Käytössä oleva objektiivi on suunniteltu pimeän taustan valaisuun, kun taas kaksi muuta objektiivia, jotka ovat nähtävissä, on tarkoitettu kirkkaan kentän heijastetun valon työhön. Näiden kahden jälkimmäisen objektiivin ympärillä olevat leveät kaulukset mahdollistavat objektiivin keskittämisen optiselle akselille. Epi-valaisimen kotelossa oleva D-kirjain tarkoittaa vaihdettavaa lisäosaa, jonka avulla laitetta voidaan käyttää pimeän kentän valaisuun. Se voidaan vaihtaa tasopeiliin kirkkaan kentän heijastetun valon mikroskopiaa varten. Läpivalaisukondensaattori on poistettu pöydän alta.
Jos objektiivi toimii omana kondensaattorinaan heijastetun valon mikroskopiassa, miksi objektiiveja ei käytetä myös läpivalaisumikroskopian valaistukseen? Sen lisäksi, että objektiivin takimmaiseen polttotasoon on käytännössä vaikea päästä käsiksi, objektiiveja on vaikea käyttää monitoimikäyttöön, eikä valaistuskulmaa ole yleensä mahdollista säätää (objektiivin takimmaisessa polttotasossa olevalla iiriskalvolla).
Kontrastin parantamisen perusperiaatteet
Kontrastin parantaminen
Kontrasti eli riittävä näkyvyys tarvitaan, jotta voimme hahmottaa mikroskooppiemme erottamat yksityiskohdat kuvasta. Selektiivisyys on tärkeää: tarvitsemme ainakin joitakin alueellisia eroja kohteen sisällä sekä kohteen ja taustan välillä havaitaksemme yksityiskohtia.
Kontrasti kuvaan saadaan kolmella tavalla, joko erikseen tai yhdessä. Ne ovat:
- kappaleen ja valon vuorovaikutus,
- valaistuksen manipulointi ja
- kuvan tallennusmedian manipulointi.
Kontrastin muuttaminen osassa c) voidaan saavuttaa valokuvakehityksen ja/tai tulostuksen avulla sekä myös analogisten video- tai digitaalisten kuvien elektronisen kontrastin avulla. Kondensaattorilla on kuitenkin keskeinen merkitys osissa (a) ja (b) kontrastin ja näkyvyyden manipuloinnissa kuvassa. Lisätietoja valomikroskopian kontrastitekniikoiden teoreettisista ja käytännöllisistä näkökohdista on kirjassa Bradbury & Evennett, 1996 ja Sanderson, 2002, 2000, 1998 ja 1994. Lyhyesti sanottuna tunnetuimpia kontrastin tuottamisen muotoja ovat kirkas kenttä, vinovalaistus, pimeä maa & Rheinberg, faasikontrasti ja DIC. Näitä menetelmiä on myös mahdollista yhdistää erilaisiin valaistusmuotoihin (esim. polarisoitunut valo Rheinbergin kanssa tai vaihekontrasti läpäisevällä kirkkaalla kentällä, johon liittyy fluoresenssi). Koska kontrastin parantaminen on hyvin pitkälti mikroskoopikon hallinnassa, kondensaattorin oikean käytön merkitystä ei voi korostaa liikaa.
Kondensaattori on fokusoitava oikein (ks. osa 3, mikroskoopin asettaminen Köhler-valaistusta varten) parhaan kuvanlaadun saamiseksi. Tämä pätee riippumatta siitä, mitä kontrastinparannusmenetelmää (kirkas kenttä, vaihe, pimeä tausta) käytetään. Kirkkaankenttämikroskopiassa fokusoimattoman kondensaattorin ilmeisin vaikutus on erottelukyvyn merkittävä heikkeneminen, mikä puolestaan aiheuttaa ”mädän” kuvan, jossa on diffraktiohaloja kuvan jokaisen pisteen ympärillä. Sama tulos syntyy, jos ylin (lyhyen tarkennuksen) linssi jätetään pois tai käännetään pois, kun käytetään suuritehoista objektiivia, eikä objektiivin takatarkennustaso täyty kokonaan valolla.
Kun faasikontrastimikroskopiaa yritetään tehdä väärin tarkennetulla kondensaattorilla, kondensaattorissa oleva rengas ei useinkaan vastaa objektiivin takatarkennustason faasirenkaan halkaisijaa, ja kontrastin paraneminen menetetään. Ongelmat kondensaattorin tarkennuksessa voivat johtaa myös huonoon pimeän taustan mikroskopointiin, jos laastaripysäkin kuva ei peitä kokonaan objektiivin suoraa valaistusta. Tämän sarjan seuraavassa osassa palataan objektiiviin ja tarkastellaan putken pituutta sekä sitä, miten objektiivin polttoväli, suurennus, aukko ja muut parametrit määritetään.
Bradbury S. & Evennett P. J. (1996) Contrast Techniques in Light Microscopy. Bios Scientific Publishers. ISBN 1-85996-085-5
Sanderson, J. B. (1994) Contrast in Light Microscopy: An Overview. Proceedings of the Royal Microscopical Society 29/4:263-270
Sanderson, J. B. (1998) Contrast Enhancement Techniques for Light Microscopy in Cell Biology: A Laboratory Handbook 2nd Edn. Cellis, J. (toim.). (1998) Vol 3: 15-33, Academic Press. ISBN (4-vol set) 0-12-164725-0; vain vol 3 = 0-12-164728-5
Sanderson, J. B. (2000) The Theory of Contrast Control in the Microscope (Kontrastin hallinnan teoriaa mikroskoopissa), Quekett Journal of Microscopy, 38:617-627.
Sanderson, J. B. (2002) Practical Control of Contrast in the Microscope (Kontrastin hallinnan käytännön hallinta mikroskoopissa), Quekett Journal of Microscopy (Mikroskooppijulkaisu), 39:275-288.