Ensaio de placas

O ensaio de placas pode ser usado para purificar uma população clonal de vírus ou para determinar o título viral como unidades formadoras de placas por ml (pfu/ml) para que quantidades conhecidas de vírus possam ser usadas para infectar células durante o trabalho subsequente. Neste ensaio, as monocamadas celulares são infectadas com uma baixa proporção de vírus, de tal forma que as células esporádicas ficam infectadas. Uma sobreposição de agarose mantém as células estáveis e limita a propagação do vírus. Quando cada célula infectada produz vírus e eventualmente lises, apenas as células imediatamente adjacentes ficam infectadas. Cada grupo de células infectadas é referido como uma placa. As células não infectadas rodeiam as placas. Após vários ciclos de infecção, as células infectadas no centro das placas começam a mentir e as células infectadas periféricas permanecem rodeadas por células não infectadas. Este fenómeno faz com que a luz que passa através das células infectadas se refraia de forma diferente das células não infectadas circundantes, e a placa pode ser visualizada a olho nu ou por microscopia de luz. Cada placa representa um único vírus. Portanto, as populações de vírus clonais podem ser purificadas através do isolamento de placas individuais. As placas individuais obtidas a partir de diluições variadas de um estoque viral podem ser contadas para determinar o título viral (pfu/ml) de uma determinada transfecção ou estoque viral. A condição das células e a sua distribuição uniforme pela superfície da placa de cultura de tecidos é importante para o sucesso de um ensaio de placas. As células devem ser saudáveis, > 95% viáveis, e em log-phase de crescimento no momento do ensaio. Células rugosas, células que não são distribuídas uniformemente na densidade correta (>70%) sobre a placa, e células que não aderem aos pratos de cultura de tecidos dentro de 30 minutos após o revestimento são prejudiciais ao ensaio.

Materiais adicionais necessários:

Agarose de ensaio em placas, Cat. No. 554766
Célula de Insectos Sem Suplementos da Graça
Soro Bovino Fetal
Prato de Cultura de Tecidos, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Cat. No. 353802
Banho-maria a 42°C

Protocolo

Determinar o número de placas necessárias

Para cada co-transfecção ou estoque de vírus (e controle positivo) fazer duplicatas de diluições em série (10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ). Etiquete cada placa de 60 mm com descrições de amostra e diluição.

Placa de cultura de sementes com células de insectos

1. Células de sementes 2,3 x 10 6 Sf9 em cada placa de 60 mm. Placas de rocha delicadamente para frente e para trás, depois lado a lado para distribuir uniformemente as células na superfície da placa. Nunca mexa na placa; isto causa uma distribuição desigual das células. Uma vez semeadas as placas, deixe as células aderirem durante 30 minutos a uma hora. Durante este tempo, preparar solução de ágar e diluições virais. Visualize, por microscopia leve, para confirmar >70% de confluência e distribuição celular uniforme.

Preparar solução de agarose

Células com uma solução de agarose a 1% em Grace’s Insect Cell Medium suplementada com 10% de FBS.

1. Primeiro, equilibre o banho de água a 42°C. Determinar o volume total de solução de agarose necessário: multiplicar 4 ml/placa pelo número de ensaios com placas. Deste volume total, uma metade será autoclavada dH 2 O + agarose para fazer uma solução de 2%, e a outra metade será Grace’s Insect Media complementada com 10% de FBS. Para determinar a quantidade, em gramas, de agarose de ensaio em placa necessária para fazer uma solução final de agarose de 1%, multiplique o volume total por 0,01. (Por exemplo, 10 placas x 4 ml = 40 ml. 40 ml X 0,01 = 0,4 gm.)
2. Adicionar a quantidade apropriada de dH 2 O autoclavado em uma garrafa de vidro estéril de tamanho apropriado. Em seguida, adicionar LENTAMENTE a quantidade calculada de agarose, enquanto gira suavemente para misturar o dH 2 O e a agarose. Micro-ondas a mistura até ferver. Retirar o frasco e inspecionar a mistura para detectar qualquer agarose não dissolvida. Se alguma estiver presente, continuar o aquecimento. Repita até que a agarose esteja completamente dissolvida (ATENÇÃO: a mistura e o vapor que a acompanha estão muito quentes e podem queimar. Utilize os equipamentos/precauções de segurança adequados). Uma vez que a agarose tenha sido completamente dissolvida, retire a tampa e transfira para o banho-maria a 42°C. Deixe a mistura arrefecer até 42°C.
3. Obtain Grace’s Insect Media e adicione Soro Bovino Fetal a 10%. Exemplo: para 100 ml de Grace’s Insect Media, adicione 10 ml de FBS. Coloque o Grace’s Media + 10% de mistura de FBS no banho-maria a 42°C.

Prepare diluições seriais virais

1. Para cada co-transfecção, rotule seis tubos estéreis de 15 ml de 10 -1 a 10 -6 com a descrição apropriada da amostra. Adicione 2,7 ml de meio TNM-FH a cada tubo. Adicione 0,3 ml do sobrenadante de co-transfecção ao primeiro tubo, tubo vortex. Realizar diluições em série, transferindo 0,3 ml para a diluição subsequente, utilizando uma pipeta fresca de cada vez.

Infectar células de monocamada

1. Neste ponto, as células tiveram tempo suficiente para aderir à superfície da placa. Verificar várias placas sob um microscópio de luz para confirmar 70% de confluência e distribuição celular uniforme.
2. Trabalhar com as placas duplicadas de cada diluição, aspirar cuidadosamente o meio das células usando uma ponta de pipeta estéril de 200 µl e vácuo. Não perturbar a folha celular. Adicionar 1 ml da diluição viral apropriada a cada uma das placas duplicadas e agitar suavemente a placa para a frente e para trás, depois de lado a lado para distribuir uniformemente o vírus. Repetir com todas as placas e diluições correspondentes.
3. Polvilha suavemente as placas à temperatura ambiente, em capuz estéril a cada 15 minutos durante 1 hora.

Células infectadas com agarose

1. Após 1 hora, confirmar que a solução de agarose está a 42°C. A solução deve estar quente o suficiente para que ainda esteja no estado líquido, mas deve estar fria o suficiente para ser mantida à mão. Se não for possível segurar confortavelmente o frasco, a solução está muito quente e matará as células Sf9. Confirme que a Grace’s Insect Media c/ 10% de FBS está a 42°C. Se assim for, adicione um volume igual à solução de agarose para completar a solução final de agarose. Misture bem a solução final de ágar-ágar.
2. Após a solução estar pronta, coloque num copo de vidro cheio com água do banho-maria. Isto deve evitar que a solução se solidifique enquanto a utiliza debaixo da campânula. Durante o procedimento, verifique periodicamente a temperatura da água no copo. Se começar a arrefecer, substitua-o por água quente do banho-maria.
3. Trabalhar com um par duplicado de cada vez, aspire cuidadosamente o meio das células utilizando uma ponta de pipeta estéril de 200 µl e aspire. Não perturbar a folha celular. Enquanto aspira, incline ligeiramente a placa e aspire o sobrenadante a partir da borda da placa. Isto permitirá uma aspiração óptima sem perturbar a folha de células. Em seguida, adicionar lentamente 4 ml de solução de ágar a cada placa e permitir que o ágar solidifique.
4. Após o ágar em todas as placas ter solidificado, coloque cuidadosamente as placas numa câmara de incubação limpa e hermética. Humidificar a câmara colocando gaze esterilizada e 10 ml de água esterilizada numa placa de cultura de 10 mm no suporte inferior da câmara de incubação. Selar a câmara e colocá-la numa incubadora a 27°C. Deixar as placas incubar durante 6 – 10 dias.
5. Plaques podem ser visualizados invertendo as placas sobre um fundo escuro e iluminando-as com uma fonte de luz forte do lado da placa, ou segurando-as num ângulo de 45° para uma fonte de luz. Ao aprender a identificar uma placa, faça um círculo com possíveis placas com um marcador. Utilizando o microscópio de luz, visualize a baixa potência para confirmar que existe uma área de clareira no relvado das células. Visualize em alta potência para procurar células infectadas na periferia da clareira, depois menos células infectadas à medida que se afasta da área da clareira.
6. Para facilitar a visualização das placas, sobreponha com 3 ml de agarose a 0,5% (preparada como descrito anteriormente) contendo 50 µg/ml de vermelho neutro. (Prepare uma solução de reserva de vermelho neutro (Sigma N7005) a 1 mg/ml em água ou PBS. Filtrar-esterilizar e armazenar a 4°C no escuro). Deixar endurecer e incubar a placa de um dia para o outro a 27°C. O vermelho neutro manchará as células saudáveis e as placas aparecerão como áreas claras, aproximadamente 0,5 – 3 mm de diâmetro contra um fundo branco. Como o vermelho neutro é um corante vital, é importante manchar enquanto a monocamada celular é saudável, ou seja, 4 a 7 dias após a infecção.

Purificação de placas a partir do estoque viral

Para garantir o isolamento adequado, é melhor que as placas sejam colhidas de placas contendo menos de 50 placas. Placas com várias diluições do vírus para garantir a obtenção de um número suficientemente baixo de placas. As placas podem ser coletadas usando pontas de micropipetas estéreis (1.000 µl) ou tubos microcapilares.

Amplify Virus from Plaque Pickup

1. Marque a placa sob a placa com um marcador. Usando uma ponta de pipeta estéril, remova um tampão de agarose diretamente sobre a placa. Colocar cada tampão de agarose num tubo de microcentrifugação separado contendo 1 ml de meio de cultura de tecido. Eluir as partículas de vírus para fora da agarose rodando o tubo durante a noite a 4°C.
2. Adicionar 200 µl de cada captador de placa para separar poços de uma placa de cultura de tecido de 12 poços semeada com 2 x 10 5 células por poço em 1 ml de meio TNM-FH fresco. Incube as placas durante 3 dias a 27°C.
3. O sobrenadante viral desta passagem – um stock pode ser recolhido e centrifugado durante 5 minutos a 1.000 x g a 4°C para remover os detritos. Armazenar a 4°C.
4. Semear uma placa de cultura de tecido de 100 mm com 5 x 10 6 células para cada placa isolada. Deixar as células fixar e substituir o meio com 10 ml de meio TNM-FH fresco.
5. Adicionar 200 µl de material de passagem – uma reserva na placa de 100 mm e incubar a 27°C durante 4 dias. Guardar o restante 800 µl da amostra – uma amostra a 4°C como reserva.
6. Colher o sobrenadante viral e centrifugar para remover os detritos. Determine o título desta passagem – estoque dois. Se o título permanecer abaixo de 2 x 10 8 pfu/ml, prossiga para Amplificação do Baculovírus.