Efeitos diferenciais na permeabilidade da membrana e viabilidade de células queratinócitas humanas submetidas a campos megasônicos de muito baixa intensidade

O efeito da exposição a US de muito baixa intensidade (Ispta entre 7 e 16 mW/cm2, bem abaixo do limiar de cavitação, 100 mW/cm2) com frequência de 1 MHz foi estudado em células HaCaT. Os experimentos foram realizados com uma configuração médica equivalente esboçada na Figura S1 do ESI, com parâmetros de tratamento variados, como Ispta, ciclo de trabalho e tempo de sonicação. Os experimentos preliminares apontaram que, na faixa de parâmetros de exposição aqui envolvidos, a temperatura permaneceu constante (dentro de 1 °C), excluindo a dissipação térmica da energia dos EUA. Além disso, os tratamentos não mostraram nenhuma dependência significativa dos efeitos estudados sobre o ciclo de trabalho das ondas nos EUA. Estas observações são consistentes com a baixa absorção dos US a 1 MHz; pelo contrário, os efeitos térmicos e o ciclo de trabalho poderiam afetar células e tecidos expostos a frequências mais altas, sendo o coeficiente de atenuação dos US proporcional à frequência23,31,

Resultados serão inicialmente apresentados considerando os dois parâmetros de exposição relevantes, tempo de sonicação e Ispta, separadamente. As alterações estruturais e físicas da membrana celular (permeabilidade, eficiência de absorção e tamanho máximo das moléculas internalizadas) serão analisadas e correlacionadas com os danos citotóxicos correspondentes e com a possível ativação de padrões inflamatórios. Posteriormente, os resultados serão interpretados em termos da dose de sonicação, definida como o produto da Ispta pelo tempo de exposição, nomeadamente a densidade superficial da energia acústica incidente sobre a amostra durante a sonicação. Na verdade, os fenómenos estudados dependem desta quantidade e isto permitiu-nos identificar uma gama de parâmetros de exposição onde ocorre um SP transitório com danos biológicos negligenciáveis.

Análise da influência do tempo de exposição US

Alterações na permeabilidade da membrana das células HaCaT induzidas por US de baixa intensidade de 1 MHz foram estimadas em termos da eficiência de absorção da calceína da sonda fluorescente verde. Uma vez que as membranas intactas são impermeáveis à calceína, ela representa um marcador confiável para SP. A percentagem de células verdes-positivas foi quantificada por análises de citometria de fluxo de acordo com a Secção 2.5.

Para avaliar a sensibilidade da permeabilidade da membrana ao tempo de exposição US, foi utilizada uma Ispta US muito baixa. Notavelmente, já uma Ispta de 7 ± 1 mW/cm2 pode ter efeitos significativos sobre a permeabilidade da membrana através de tempos de exposição adequados. Resultados representativos da investigação da citometria de fluxo paralelo em células HaCaT e NIH-3T3, ambos sonicados em Ispta ~7 mW/cm2 para 5′, 15′, 30′ e 45′ são mostrados na Fig. 1 (triângulos vermelhos e quadrados azuis, respectivamente). Como esperado, a comparação entre as linhas celulares após baixos tempos de sonicação (abaixo do limiar de sonoporação) resulta em uma pequena afinidade da calceína, onde as diferenças (as mais altas nas células HaCaT) devem levar em conta suas respectivas características de composição e permeabilidade da membrana. Mais importante, ambas as linhas celulares mostram um aumento significativo da eficiência de captação a partir de 15′ de exposição, o que corresponde a uma dose de sonicação de (6,3 ± 0,9) J/cm2, sugerindo a ativação do processo de SP. De acordo com os melhores ajustes da Fig. 1, para maiores tempos de exposição, nossos experimentos apontam uma correlação linear entre a eficiência de captação e o tempo de exposição, com uma taxa de captação idêntica induzida pelos EUA tanto em células HaCaT quanto NIH-3T3 (declives de regressão linear (%/min) 1,3 ± 0,2, e 1,4 ± 0,2, para HaCaT e NIH-3T3, respectivamente). Isso significaria que o aumento da eficiência de captação devido a SP é um fenômeno independente da linha de células.

Para aprofundar a investigação do processo de SP e caracterizar a internalização, as células HaCaT tratadas foram avaliadas por microscopia de fluorescência. Consistente com os resultados da citometria de fluxo, as amostras filtradas para 5′ não mostram nenhuma alteração significativa na permeabilidade da membrana em relação à amostra controle (não tratada), enquanto a partir de 15′ observa-se um aumento na eficiência de captação (como mostrado na Fig. 2 e na Figura S2 do ESI), embora nem todas as células mostraram fluorescência. De forma correspondente, as células parecem menos densas e aderentes em relação à amostra de controle, sugerindo um afrouxamento das uniões herméticas. As imagens representativas da Fig. 2 sugerem uma localização heterogênea da calceína dentro das células e, de fato, a microscopia de fluorescência confocal permitiu distinguir claramente dentro das células HaCaT a distribuição periférica da sonda da interna (ver imagem e reconstruções em 3D da Fig. 3). Mais imagens detalhadas são mostradas na secção 3 do ESI. As observações são consistentes com uma captação de dois níveis da fluoroprobe: um periférico, onde a sonda está localizada na rede de retículo endoplasmático ao redor da membrana plasmática; o outro, exibido significativamente após exposição em 30′, onde a difusão da sonda no citoplasma causa uma intensa fluorescência uniformemente distribuída por toda a célula, incluindo o nucleoplasma. Deve-se notar que o diâmetro de Stokes da calceína é de ~1,36 nm e seu transporte intranuclear não é dificultado por barreiras difusivas29. Uma análise mais completa relatada nas seções 3.2 e 3.3 permite concluir que a dose US de exposição e o peso molecular da sonda foram fatores dominantes na determinação da captação.

Foi realizado um novo ensaio baseado na fluoroproteína PI vermelha para avaliar a recuperação da permeabilidade da membrana nativa das células soniculares (ver também seção 2.3). A internalização da PI denota a ativação de processos citotóxicos. A co-localização das colorações verde e vermelha dentro das células indica, portanto, o fracasso do processo de recuperação da membrana após SP. Por outro lado, a observação nas células da fluorescência verde na ausência da vermelha indica a ocorrência de SP de membrana durante o tratamento nos EUA e sua recuperação bem sucedida após o desligamento do campo. As imagens representativas da fluorescência confocal são mostradas na Fig. 4. A co-localização dos dois corantes está ausente nas células tratadas para 15′, enquanto é pouco observada após 30′ de exposição (Figura S5 do ESI). Consistentemente, uma perda líquida de viabilidade de ~5% foi revelada, conforme verificado pela citometria de fluxo. Nas células filtradas para 45′, correspondente a uma dose de (19 ± 3) J/cm2, a co-localização parece mais evidente (ver setas brancas na Fig. 4B) e ocorre uma perda de viabilidade mais significativa (~10%, como verificado pela citometria de fluxo). Estes achados sugerem que um maior tempo de exposição, correspondente a uma dose mais elevada em Ispta fixa, induz uma alteração irreversível na estrutura da membrana seguida por uma consequente resposta citotóxica.

Análise da influência da intensidade dos US

O efeito da variação da intensidade do campo US aplicado na permeabilidade da membrana foi analisado na linha celular HaCaT após 15′ da exposição, suficientemente curto para excluir os efeitos induzidos por uma sonicação de longa duração. Em nosso estudo, as intensidades de US estavam na faixa entre Ispta = (7 ± 1) mW/cm2 e Ispta = (16 ± 1) mW/cm2, bem abaixo do limiar de cavitação24. De acordo com o protocolo descrito nas seções 2.3 e 2.5, foram utilizados dextrans marcados com FITC de diferentes MW (MW = 10, 40 e 70 kDa) para caracterizar, para cada intensidade de US, a indução de permeabilidade da membrana ao tamanho da molécula diferente. Este procedimento permite, por sua vez, avaliar o tamanho do sonóforo. Assim como na calceína, os dextrans não entram significativamente nas células não tratadas31,32, enquanto no regime de cavitação dos EUA a captação celular dos dextrans marcados com FITC pode ser fortemente aumentada tanto pelo SP quanto pela promoção do tráfico de endossomos30. Nesse sentido, os resultados das medidas de citometria de fluxo relatados na Figura 5 mostram claramente uma captação dependente do tamanho, fenômeno que nos permite excluir a concomitância de efeitos de endocitose ativa e, de acordo com a literatura22, sugere o SP de baixa intensidade como o principal mecanismo envolvido no transporte de moléculas de dextrans através da membrana plasmática. Especificamente, a captação observada de SP induzida é caracterizada por um limiar Ispta, aumentando linearmente com o aumento do MW das moléculas internalizadas. Abaixo deste limiar, a eficiência de absorção das células tratadas é comparável à das células não-expostas. Os valores do limiar Ispta são reportados na Tabela 1. Para intensidades acima do limiar, a eficiência de absorção aumenta com o aumento da Ispta até que um máximo seja alcançado. Para o dextrano de 10 kDa, então ele diminui ligeiramente para um platô. A diminuição observada da eficiência de captação em altas intensidades pode ser explicada pelo aumento do número de células mortas, que são removidas da amostra ao enxaguar, não contribuindo assim para as análises da citometria de fluxo. Além disso, a ativação de processos apoptóticos pode dificultar a internalização do corante. Notavelmente, para Ispta = 15 mW/cm2 embora este valor seja muito inferior ao limiar de cavitação, as células são capazes de internalizar 70 kDa dextrans, com um diâmetro de Stokes de ~12 nm. Este valor pode ser tomado como uma estimativa do tamanho mínimo dos sonoporos produzidos na membrana. Na Figura S6 (Seção 4 do ESI) é relatado um conjunto de imagens fluorescentes representativas exibindo a captação de dextrans no limiar Ispta juntamente com o teste PI.

A internalização da PI aponta uma resposta citotóxica significativa na Ispta = 15 mW/cm2 (dose de exposição 13,5 J/cm2). Como relatado por Udroiu et al.13 em condições experimentais similares, também foi observado um aumento leve, porém significativo, da incidência de micronúcleos nas células NIH-3T3, dependendo da intensidade e do tempo de exposição a 1 MHz US. Essas observações sugeriram que mais estudos foram necessários para melhor compreender os bioefeitos que acompanham a membrana SP e, portanto, um estudo da resposta biológica das células filtradas em função da intensidade dos US.

A resposta biológica às “feridas de membrana” induzidas por SP induzidas por intensidades muito baixas de US foi completamente caracterizada pela avaliação da morte celular, usando o ensaio combinado de AnnexinV e PI descrito na Seção 2.5 (ver também a Seção 5 do ESI). Também avaliamos a expressão do gene IL-6, uma citocina que liga a inflamação crônica ao câncer33,34. Os resultados da análise da citometria de fluxo, expressos em termos de percentagem celular, são relatados na Fig. 6. A viabilidade celular é preservada principalmente (>90%) durante os tratamentos em 15′, porém, a partir de Ispta = 9 mW/cm2 ocorre uma leve diminuição, acompanhada de um aumento das células apoptóticas precoces. Na Ispta = 14 mW/cm2 uma percentagem significativa de células necróticas começa a ser observada, enquanto na Ispta = 16 mW/cm2 também a apoptose tardia contribui para a morte celular, em correspondência com uma ligeira redução da necrose (pontos representativos da citometria de fluxo na Figura S7 do ESI). A expressão do gene IL-6 foi determinada por RT-PCR (Fig. 7). Não foi observado nenhum up-regulation para Ispta ≤15 mW/cm2 enquanto o tratamento a 16 mW/cm2 induziu uma superexpressão deste gene em comparação com o das células não tratadas.

Estes achados sugerem que, partindo de um limiar Ispta de 16 mW/cm2 e 15′ de sonicação, a lesão da membrana causada pelos EUA não só diminui a viabilidade celular, mas também, através da superexpressão do gene IL-6 relacionado à inflamação, poderia induzir uma resposta inflamatória. Como várias pesquisas reconheceram um papel da inflamação na promoção da patogênese e da progressão de doenças como o câncer35,36, é necessária mais investigação para melhor caracterizar os aspectos relacionados com os padrões inflamatórios.

Análise da influência da dose de sonicação

Para analisar quantitativamente a relação entre o campo US aplicado e os efeitos biológicos observados em termos da energia fornecida às células durante a exposição, a dose de sonicação foi calculada para cada tratamento como o produto da intensidade Ispta pelo tempo de exposição. Os valores obtidos são relatados na Tabela 2, onde os efeitos biológicos observados são identificados pelas cores de fundo. Os nossos resultados sugerem que a membrana SP ocorre a partir de uma dose limite de cerca de 6,3 J/cm2. Além disso, o tamanho dos sonoporos pode estar relacionado com a dose de sonicação. Para doses superiores a 10,8 J/cm2 observa-se uma diminuição da viabilidade e eventos concomitantes de apoptose precoce na célula tratada, seguida a partir de 14,4 J/cm2 por apoptose tardia, necrose e superexpressão de IL-6.

Ressaltamos que esta dose, e Ispta 16 mW/cm2, corresponde a um pico de pressão negativa de ~0.02 MPa. Este valor parece suficientemente alto para induzir estresse mecânico na interface membrana plasmática/água, embora caia uma ordem de magnitude inferior ao valor do limiar de exposição de segurança sugerido até agora (índice mecânico ~0,2-0,3, a 1 MHz).

Nota que nossos experimentos foram comparados com sucesso com aqueles realizados usando um sistema eletromédico realmente empregado na terapia dos EUA (ver também seção 2.2), destacando assim a relevância médica de nossa abordagem. A este respeito, estamos confiantes que o fornecimento de informações sobre a dose de sonicação (na freqüência fixa dos EUA) permite um índice mais completo de caracterização da resposta celular à exposição aos EUA e, por sua vez, uma identificação fina de uma gama de parâmetros onde SP transiente ocorre com danos biológicos insignificantes.

Um passo muito importante para compreender o impacto biológico in vivo dos nossos resultados seria operar as exposições aos US em biossistemas tridimensionais, tais como tecidos humanos compostos por queratinócitos multifacetados ou por células endoteliais da barreira cerebral do sangue.