Efter sin eksamen fra Southwest Texas State University i San Marcos, Texas, blev Boothe medlem af repertoirekompagniet på Oregon Shakespeare Festival, hvor han spillede roller i Henry IV, del 2 (som Henry IV af England), Troilus og Cressida og andre. Han debuterede på scenen i New York i 1974 i Lincoln Center-opsætningen af Richard III i 1974. Fem år senere fik han sin teaterdebut på Broadway i en hovedrolle i enakterne Lone Star, skrevet af James McLure.
Boothe fik første gang national opmærksomhed i 1980, da han spillede Jim Jones i CBS-TV-filmen Guyana Tragedy: The Story of Jim Jones. Boothes portræt af den vanvittige kultleder fik rosende omtale af kritikerne. I Time’s historie om produktionen blev Boothe rost: “Der er en ekstraordinær præstation. En ung skuespiller ved navn Powers Boothe fanger hele karismaen og ondskaben hos ‘far’, Jim Jones.” Boothe vandt en Emmy Award for sin rolle og slog dermed veteranerne Henry Fonda og Jason Robards. Da Screen Actors Guild var i strejke i efteråret 1980, var han den eneste skuespiller, der krydsede strejkeposterne for at deltage i ceremonien, og han sagde dengang: “Dette kan enten være det modigste øjeblik i min karriere eller det dummeste.”
Boothe portrætterede Philip Marlowe i en tv-serie baseret på Raymond Chandlers noveller for HBO i 1980’erne. Han medvirkede i film som Southern Comfort, A Breed Apart, Red Dawn, The Emerald Forest, Rapid Fire og Extreme Prejudice, samt HBO-filmene Into the Homeland og By Dawn’s Early Light. Desuden medvirkede han i CBS-TV-filmen Family of Spies fra 1990, hvor han spillede forræderofficer John Walker fra flåden. Boothe spillede Curly Bill Brocius i den succesfulde westernfilm Tombstone fra 1993, den illoyale ledende officer fra hæren i Blue Sky (over for Jessica Langes Oscar-vindende præstation) og den uhyggelige ledende terrorist i Sudden Death. Han var også en del af de store ensemblebesætninger i Oliver Stones Nixon (som stabschef Alexander Haig) og U Turn (som byens sherif).
I 2001 spillede han hovedrollen som Flavius Aëtius, den romerske general med ansvar for at standse hunnerinvasionen, i tv-miniserien Attila. Boothe spillede en hovedrolle som bordelejeren Cy Tolliver i HBO-serien Deadwood og den skumle senator Roark i biograffilmen Sin City (2005) samt i efterfølgeren Sin City: A Dame to Kill For (2014). Han er stemmen til en af figurerne i videospillet Area 51 fra 2005 og til Gorilla Grodd, den hyperintelligente telepatiske superskurk i Justice League og Justice League Unlimited. Han lagde stemme til skurken, Kane, i videospillet Turok fra 2008.
Han var en særlig gæstestjerne i 24, hvor han spillede vicepræsident Noah Daniels. Han vendte tilbage i forfølgeren til den syvende sæson, 24: Redemption. Lige efter at Boothe har overtaget rollen som fungerende præsident, ses han på vej ud af Air Force Two med F-15-fly i baggrunden. Boothe spillede en nedskudt F-15-pilot i Red Dawn. I marts 2008 fortalte han en tv-kampagneannonce for senator John McCains præsidentkampagne.
I 2012 optrådte Boothe i Joss Whedons The Avengers i en hemmelighedsfuld rolle som en skyggefuld regeringsoverordnet overordnet for S.H.I.I.E.L.D. I 2015-16 gentog han rollen, nu under navnet Gideon Malick, i ABC’s Agents of S.H.I.E.L.D.
Boothe optrådte i 2012 i miniserien Hatfields & McCoys som dommer Valentine “Wall” Hatfield. Boothe var også med i rollen som Lamar Wyatt i ABC’s musikalske dramaserie Nashville. Boothe lånte også sin stemme til Hitman: Absolution, et videospil fra 2012 udviklet af IO Interactive, hvor han lagde stemme til karakteren Benjamin Travis.