PMC

TEXT

Streptokokker er de hyppigste indbyggere i den menneskelige mund (6, 24), og de får hyppigt adgang til blodbanen gennem parodontale læsioner eller mundskrabninger, der opstår ved rutinemæssige aktiviteter (32). Dette kan føre til alvorlige sygdomme, herunder infektiøs endokarditis (IE) (28) og neutropenisk bakteriæmi (29). Taxonomien af de orale streptokokker har længe været en kilde til forvirring (4, 9, 20, 22, 31). Sekventering af 16S rRNA-genet har gjort situationen meget klarere (13); denne metode mangler dog den fornødne følsomhed til at skelne visse nært beslægtede arter, herunder Streptococcus mitis og Streptococcus oralis (12), eller til at muliggøre stamtypebestemmelse eller fylogenetisk analyse inden for arterne. Man har derfor undersøgt gener med større variabilitet, herunder 16S-23S rRNA intergenic transcribed spacer (ITS) (2), proteinkoderende husholdningsgener (1, 5, 7, 10, 12, 12, 14, 15, 19, 23) eller begge dele (17, 18). Der er endnu ikke opnået konsensus om, hvilke(t) gen(er) der er bedst egnet(e) til disse formål. Selv om tidligere undersøgelser har identificeret orale streptokokker fra kliniske blodkulturer ved hjælp af definitive sekventeringsmetoder (12, 23, 30), har ingen af dem rapporteret detaljerede kliniske oplysninger om den underliggende sygdom. Vi satte os for at gøre begge dele.

Blodstrømskulturer udført på Virginia Commonwealth University Medical Center Hospital fra maj 2003 til maj 2008 blev præsumptivt identificeret som indeholdende streptokokker af det kliniske mikrobiologiske laboratorium. Der blev anvendt et computerskript til at udelukke ikke-orale arter. For at undgå analyse af kontaminanter blev der kun anmodet om isoleringsplader, når to eller flere rapporter stammede fra separate kulturer af den samme patient. En koloni fra hver tilgængelig isoleringsplade blev dyrket i bouillonkultur og undersøgt makroskopisk og mikroskopisk. Hvis der blev observeret forskelle i separate kulturer fra den samme patient, blev begge kulturer beholdt. I modsat fald blev en enkelt kultur fra hver patient kryokonserveret, og der blev udtaget alikvater til PCR-amplifikation.

For at bestemme artsidentiteten og den fylogenetiske beslægtethed af hvert isolat blev 16S-23S ITS amplificeret ved hjælp af de tidligere beskrevne 6R- og 13BF-printere (2). Da der ikke blev opnået produkter fra nogle isolater, bemærkede vi, at de sidste tre nukleotider i 6R-præmmeren ikke flugter med 23S rRNA-sekvenser i GenBank fra flere arter af interesse. Vi forkortede og forenklede derfor 6R-primeren og skabte 6R-S, og vi forkortede 13BF-primeren for at tilpasse dens annealingstemperatur (se tabel S1 i det supplerende materiale). En lignende ændring af 6R-primeren blev rapporteret for nylig (18). Ved hjælp af disse primere blev der opnået PCR-amplikoner fra alle isolater og indsendt til kapillær DNA-sekvensanalyse.

De fleste DNA-sekvenser indeholdt den komplette ITS og dele af 16S- og 23S-rRNA-generne, som blev afstemt med ITS-sekvenser fra typestammer, der er tilgængelige i GenBank eller bestemt af os fra stammer, der er opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Vi fandt, at flankerende 16S- og 23S-sekvenser, selv om de ikke er bevaret i de fleste offentliggjorte sekvenser, lettede ITS-justeringen. Der er faktisk offentliggjort mindst fire sekvenser af typestammer (18), hvor en CTAAGG, der ligger 78 bp før 3′-enden af 16S rRNA-genet, tilsyneladende er blevet forvekslet med en identisk sekvens af hexanukleotid, der tidligere (2) er defineret som begyndelsen af ITS. Trimmede ITS-sekvenser (2) blev derefter sammenlignet og justeret med MEGA 4 software (25) for at konstruere et nabo-sammenføjende fylogenetisk træ (fig. 1).

Det er tidligere blevet foreslået, at ITS-analyse alene er tilstrækkelig til artsidentifikation af orale streptokokker, herunder af de nært beslægtede arter S. mitis og S. oralis. Konserverede enkeltbase-deletioner på to steder og en samlet ITS-længde på 246 bp blev foreslået som værende karakteristiske for S. oralis, mens S. mitis blev foreslået at mangle disse deletioner og besidde en ITS på 248-249 bp (2, 3). I vores undersøgelse fandt vi isolater af begge arter, der besad begge deletioner eller ingen af dem, sammen med overlappende ITS-længder. S. oralis- og S. mitis-isolaterne kunne således ikke adskilles pålideligt ud fra disse kriterier. En anden undersøgelse har antydet, at ITS-sekvensanalyse, selv om den ikke er tilstrækkelig til at skelne S. oralis og S. mitis, er tilstrækkelig til identifikation af mange andre orale streptokok-arter, herunder dem, der tilhører anginosus-gruppen (18). Vi fandt imidlertid et isolat af anginosus-gruppens art S. intermedius (VMC38), som ikke kunne klassificeres ved hjælp af ITS (se Tabel S1 i det supplerende materiale).

Et stort antal isolater, især for S. mitis og Streptococcus constellatus, besad også identiske sekvenser, hvilket udelukkede fylogenetisk analyse. Identiske sekvenser blev også opnået fra fem par isolater, der stammer fra de samme patienter (data ikke vist).

Da ITS-analysen ikke var tilstrækkelig til vores formål, sekventerede vi et andet fælles mål – sodA-genet, der koder for manganafhængig superoxiddismutase (1, 5, 10, 12, 12, 14, 19, 27). Dette gjorde det muligt at udelukke flere isolater. De ovennævnte stammepar, der stammer fra de samme personer og har identiske ITS-sekvenser, havde også identiske sodA-sekvenser, hvilket bekræftede, at isolaterne var identiske, og et isolat fra hvert par blev udeladt. To isolater blev udeladt på grund af en åbenlys fejl i håndteringen af stammerne, og et andet blev ikke bibeholdt, fordi ITS- og sodA-sekvenserne viste, at det var en stamme af Enterococcus faecalis. Et fylogenetisk træ afledt af de resterende isolater er vist i fig. 1.

Den sodA-lignment var overlegen i forhold til ITS-systemet med henblik på fylogenetisk analyse. De eneste isolater med identiske sodA-sekvenser var to S. mitis-stammer og to stammer af Streptococcus vestibularis. SodA-lignmentet var også mere nyttigt til artsbestemmelse. Alle referencestammer var godt adskilt fra hinanden i det fylogenetiske træ. Resultatet var kun fire tvetydige artstilknytninger for sodA, sammenlignet med 15 for ITS (se tabel S1 i det supplerende materiale). I de tilfælde, hvor en enkelt artsbetegnelse var i overensstemmelse med både ITS- og sodA-sekvenserne, blev denne betegnelse anvendt. Kun 3 af de endelige 58 kliniske isolater kunne ikke identificeres sikkert ved hjælp af denne metode. VMC1- og VMC43-isolaterne producerede ITS-sekvenser, der var for korte til at være informative på trods af gentagne sekventeringsforsøg, og VMC58 blev inkonsekvent identificeret ved hjælp af ITS- og sodA-sekvenser (Fig. 1; Tabel S1). Vi bekræftede artsidentiteten af disse isolater ved hjælp af en nyligt offentliggjort database, der indeholder sekvenser af syv housekeeping gener fra 420 velkarakteriserede streptokokstammer, herunder sodA, pfl og pyk (1). Sekvenserne af pfl- og/eller pyk-generne fra alle tvivlsomme stammer blev bestemt og afstemt med sekvenserne i eMLSA.net-databasen (http://www.emlsa.net/), ligesom de eksisterende sodA-sekvenser. I alle tilfælde var pfl- og pyk-arttilknytningerne i overensstemmelse med dem fra sodA. Desuden viste sodA-justeringen, at VMC58-sekvensen, selv om den afviger fra typestammen, faldt inden for en klynge af 13 Streptococcus infantis-isolater i databasen (data ikke vist). Konsensus artsidentifikationen af alle isolater, der er inkluderet i undersøgelsen, er angivet i Fig. 1 og Tabel S1 og S2 i det supplerende materiale.

Selv om disse resultater tyder på, at sodA-analyse alene er tilstrækkelig til at identificere de fleste stammer, anbefaler vi, at der medtages mindst ét ekstra protein-kodende husholdningsgen for alle stammer. Mange orale streptokokker er naturligt kompetente, og tilfælde af erhvervelse af fremmede husholdningsgener, herunder sodA, er blevet rapporteret (1, 12). Dette var ikke tydeligt i vores undersøgelse, men der var tilfælde af kimeriske ITS-sekvenser (VMC38 og VMC50) og sodA-sekvenser (VMC33). To nyere publikationer er gået videre og foreslår hver især sekventering af et andet sæt af syv husholdningsgener med henblik på multilocus-sekventypning (7) eller multilocus-sekvensanalyse (1). Disse fremgangsmåder er baseret på analyse af et større antal gener for at opnå øget opløsning og minimere virkningerne af lejlighedsvise chimære eller fremmede gener (1, 7). Disse ordninger giver også mulighed for mere sofistikerede fylogenetiske analyser end dem, der er mulige med kun to eller tre gener. Vi oplevede dog lejlighedsvis vanskeligheder med at amplificere og sekventere pfl og pyk og havde kun ringe succes med to af de andre anbefalede gener, map og ppaC (1). I en anden nylig undersøgelse blev der rapporteret om lignende vanskeligheder (27). Valget af yderligere gener kan således kræve empirisk afprøvning, men de gener, der anvendes i analyserne med syv gener, bør undersøges først, da store samlinger af sekvenser fra velkarakteriserede stammer er tilgængelige til sammenligning (1, 7).

Så vidt vi ved, er dette kun den anden rapport om et Streptococcus australis- (12) eller S. infantis- (30) blodkulturisolat. Den eneste anden forbindelse mellem sidstnævnte art og en sygdom stammer fra to rapporter om dens isolering fra sputum fra voksne med cystisk fibrose (17, 26). Det er derfor interessant, at en voksen med cystisk fibrose var kilden til vores S. infantis-isolat, VMC58 (se tabel S2 i det supplerende materiale).

Antibiotikafølsomhedsdata er inkluderet i tabel S2 og er stort set i overensstemmelse med tidligere undersøgelser (8). Tabel S2 indeholder også kliniske og demografiske data for kildepatienterne, idet de kategoriseres ud fra den primære underliggende sygdom: medicinsk sygdom, malignitet, IE eller kirurgi/traume. Alle IE-emner blev diagnosticeret klinisk, og alle undtagen VMC56-tilfældet (tabel S2) blev klassificeret som “sikker IE” efter de modificerede Duke-kriterier (16). Den eneste undtagelse havde en historie med tidligere IE og intravenøs brug af narkotika (IVDU), hvilket sammen med de positive blodkulturer ville resultere i en kategorisering som “mulig IE”. Data om mulige infektionskilder, herunder centrale linjer, gastrointestinal endoskopi, oral mucositis, tandforhold og IVDU, blev også undersøgt. IVDU blev fundet for 9 af de 13 IE-patienter og for kun 1 anden patient i undersøgelsen (tabel S2). Denne forskel var statistisk signifikant (P < 0,0001; Fisher’s eksakte test). Således var IVDU en overvældende risikofaktor, selv om denne undersøgelse fokuserede på orale arter.

Vores fylogenetiske analyse afdækkede ingen statistisk signifikante sammenhænge mellem en bestemt art eller klontype og underliggende sygdom eller andre kliniske parametre, herunder antal hvide blodlegemer, højeste temperatur, vegetationsstørrelse, påvirket ventil eller patientens død. En tidligere undersøgelse indeholdt tilstrækkelige oplysninger til at identificere arter isoleret fra neutropeniske patienter (12). Vores resultater lignede hinanden, idet 11 ud af 12 isolater i den undersøgelse og 9 ud af 10 i vores undersøgelse (Tabel S2) var enten S. mitis eller den nært beslægtede S. oralis. I vores undersøgelse var disse to arter tilsammen signifikant mere sandsynlige end de 12 resterende arter tilsammen for at blive isoleret fra neutropeniske patienter (P = 0,004; Fisher’s exact test). Dette kan afspejle prævalensen af disse arter i mundhulen. Det er dog interessant, at denne tendens ikke blev overført til IE. Ved at kombinere vores data med dataene fra samme undersøgelse (12) for neutropeni og IE blev S. oralis og S. mitis isoleret fra 20 ud af 22 neutropenitilfælde og kun 15 ud af 27 IE-tilfælde, en forskel, der var statistisk signifikant (P = 0,01; Fisher’s exact test). Som i tidligere undersøgelser (11, 12, 30) begrænsede stikprøveantallet vores evne til med sikkerhed at vurdere andre mulige sammenhænge mellem arter og bestemte sygdomme eller kliniske karakteristika. Ved at parre endelig artsidentifikation med kliniske og demografiske karakteristika for hver kildepatient (tabel S2) har vi imidlertid forsøgt at gøre vores resultater egnede til metaanalyse eller andre undersøgelser, der anvender kombinerede data.