Plaque assayet kan bruges til at rense en klonal population af virus eller til at bestemme viral titer som plaque-dannende enheder pr. ml (pfu/ml), således at kendte mængder virus kan bruges til at inficere celler under efterfølgende arbejde. I denne test inficeres cellemonolag med en lav virusmængde, således at sporadiske celler inficeres. Et overlay af agarose holder cellerne stabile og begrænser spredningen af virus. Når hver enkelt inficeret celle producerer virus og til sidst lyserer, er det kun de umiddelbart tilstødende celler, der bliver inficeret. Hver gruppe af inficerede celler betegnes som en plak. Ikke-inficerede celler omgiver plakkerne. Efter flere infektionscyklusser begynder de inficerede celler i midten af plakkerne at lyse, og de perifere inficerede celler forbliver omgivet af uinficerede celler. Dette fænomen bevirker, at det lys, der passerer gennem de inficerede celler, brydes anderledes end de omkringliggende uinficerede celler, og plakken kan visualiseres enten med det blotte øje eller ved lysmikroskopi. Hver plak repræsenterer en enkelt virus. Klonale viruspopulationer kan derfor oprenses ved at isolere de enkelte plaques. Individuelle plaques, der er opnået fra forskellige fortyndinger af et virusmateriale, kan tælles for at bestemme virustiteren (pfu/ml) for en given transfektion eller et givet virusmateriale. Det er vigtigt, at cellernes tilstand og deres jævne fordeling over vævskulturpladens overflade er afgørende for, om en plakatanalyse bliver en succes. Cellerne skal være sunde, > 95 % levedygtige og i logfasevækst på tidspunktet for analysen. Klumpede celler, celler, der ikke er jævnt fordelt med den korrekte tæthed (>70%) over pladen, og celler, der ikke klæber til vævskulturskålene inden for 30 minutter efter udpladning, er skadelige for assayet.

Der kræves yderligere materialer:

Plaque Assay Agarose, Cat. nr. 554766
Grace’s Unsupplemented Insect Cell Medium
Fetal Bovine Serum
Tissue Culture Dish, 60 x 15 mm, BD Falcon™ Cat. Nr. 353802
42°C vandbad

Protokol

Bestem antallet af plader, der er nødvendige

For hver co-transfektion eller virusopbevaring (og positiv kontrol) udarbejdes dubletter af serielle fortyndinger (10 -3, 10 -4, 10 -5, 10 -6 ). Hver 60 mm plade mærkes med prøve- og fortyndingsbeskrivelser.

Sæt kulturplade med insektceller

  1. Sæt 2,3 x 10 6 Sf9-celler på hver 60 mm plade. Vug forsigtigt pladerne frem og tilbage og derefter fra side til side for at fordele cellerne jævnt på pladens overflade. Pladen må aldrig hvirvles rundt; dette medfører ujævn cellefordeling. Når pladerne er blevet udsået, skal man lade cellerne hæfte i 30 minutter til en time. I løbet af denne tid forberedes agaropløsning og virale fortyndinger. Visualiser ved hjælp af lysmikroskopi for at bekræfte >70% konfluens og jævn cellefordeling.

Forbered agaroseopløsning

Pladerede celler overlejres med en 1% agaroseopløsning i Grace’s Insect Cell Medium suppleret med 10% FBS.

  1. Først skal vandbadet equilibreres til 42°C. Bestem den samlede mængde agaropløsning, der er nødvendig: multiplicer 4 ml/plade med antallet af plaqueassays. Af dette samlede volumen skal den ene halvdel være autoklaveret dH 2 O + agarose til en 2 % opløsning, og den anden halvdel skal være Grace’s Insect Media suppleret med 10 % FBS. For at bestemme mængden i gram agarose til plakatforsøg, der er nødvendig for at fremstille en endelig 1 % agaroseopløsning, multipliceres det samlede volumen med 0,01. (F.eks. 10 plader x 4 ml = 40 ml. 40 ml X 0,01 = 0,4 gm.)
  2. Der tilsættes den passende mængde autoklaveret dH 2 O i en steril glasflaske af passende størrelse. Derefter tilsættes LANGSOMT den beregnede mængde agarose, mens der forsigtigt omrystes for at blande dH 2 O og agarose. Blandingen kommes i mikrobølgeovn, indtil den lige akkurat koger. Flasken fjernes, og blandingen undersøges for eventuel uopløst agarose. Hvis der er noget til stede, fortsættes opvarmningen. Gentag processen, indtil agarosen er helt opløst (FORSIGTIG: Blandingen og den ledsagende damp er meget varm og kan brænde. Brug passende sikkerhedsudstyr/forholdsregler). Når agarosen er helt opløst, lukkes flasken løst og overføres til vandbadet på 42 °C. Lad blandingen afkøle til 42 °C.
  3. Opnå Grace’s Insect Media og tilsæt føtalt oksekødsserum til 10 %. Eksempel: Til 100 ml Grace’s Insect Media tilsættes 10 ml FBS. Anbring blandingen af Grace’s media + 10 % FBS i vandbadet ved 42 °C.

Forbered virale serielle fortyndinger

  1. For hver co-transfektion mærkes seks sterile rør på 15 ml fra 10 -1 til 10 -6 med den relevante prøvebeskrivelse. Der tilsættes 2,7 ml TNM-FH-medie til hvert rør. Tilsæt 0,3 ml af co-transfektionens supernatant til det første rør, vortex røret. Udfør serielle fortyndinger ved at overføre 0,3 ml til den efterfølgende fortynding ved hjælp af en ny pipette hver gang.

Inficer monolagsceller

  1. På dette tidspunkt har cellerne haft rigeligt med tid til at klæbe til pladens overflade. Kontroller flere plader under et lysmikroskop for at bekræfte 70 % konfluens og jævn cellefordeling.
  2. Arbejd med duplikatpladerne af hver fortynding, sug omhyggeligt medierne fra cellerne ved hjælp af en steril 200 µl-pipettespids og vakuum. Cellepladen må ikke forstyrres. Der tilsættes 1 ml af den relevante virale fortynding til hver af duplikatpladerne, og pladen vendes forsigtigt frem og tilbage og derefter fra side til side for at fordele virus jævnt. Gentag med alle tilsvarende plader og fortyndinger.
  3. Vippe forsigtigt pladerne ved stuetemperatur i steril emhætte hvert 15. minut i 1 time.

Overlay inficerede celler med agarose

  1. Efter 1 time bekræftes det, at agaroseopløsningen er ved 42 °C. Opløsningen skal være varm nok til, at den stadig er i flydende tilstand, men den skal være kølig nok til, at den kan holdes i hånden. Hvis du ikke kan holde flasken behageligt, er opløsningen for varm, og den vil dræbe Sf9-cellerne. Bekræft, at Grace’s Insect Media m/ 10% FBS er ved 42°C. Hvis det er tilfældet, tilsættes en tilsvarende mængde til agaroseopløsningen for at supplere den endelige agaropløsning. Bland den endelige agaropløsning godt.
  2. Når opløsningen er klar, anbringes den i et glasbægerglas fyldt med vand fra vandbadet. Dette skulle forhindre opløsningen i at størkne, mens du bruger den under emhætten. Under proceduren skal du med jævne mellemrum kontrollere temperaturen af vandet i bægerglasset. Hvis det begynder at afkøle, erstattes det med varmt vand fra vandbadet.
  3. Arbejder du med et dubletpar ad gangen, skal du forsigtigt suge medierne fra cellerne ved hjælp af en steril 200 µl-pipettespids og vakuum. Cellepladen må ikke forstyrres. Mens du suger, skal du tippe pladen let og støvsuge supernatanten fra kanten af pladen. Dette giver optimal sugning uden at forstyrre cellepladen. Derefter tilsættes langsomt 4 ml agaropløsning til hver plade, og agaren stivner.
  4. Når agaren på alle plader er stivnet, anbringes pladerne forsigtigt i et rent, lufttæt inkubationskammer. Befug kammeret befugtes ved at placere steril gaze og 10 ml sterilt vand i en 10 mm kulturskål på den nederste rist i inkubationskammeret. Kammeret forsegles og anbringes i et inkubator på 27 °C. Lad pladerne inkubere i 6-10 dage.
  5. Plaques kan visualiseres ved at vende pladerne på en mørk baggrund og belyse dem med en stærk lyskilde fra siden af pladen eller ved at holde dem i en vinkel på 45° ind mod en lyskilde. Når du lærer at identificere en plakat, skal du omringe mulige plakater med en markør. Ved hjælp af lysmikroskopet visualiseres ved lav effekt for at bekræfte, at der er et område med lysning i græsplænen af celler. Visualiser ved høj effekt for at se efter inficerede celler i periferien af lysningen og derefter mindre inficerede celler, efterhånden som du bevæger dig væk fra området med lysning.
  6. For at lette visualiseringen af plaques, overlejres med 3 ml 0,5 % agarose (fremstillet som tidligere beskrevet) indeholdende 50 µg/ml neutral rød. (Forbered neutral rød (Sigma N7005) stamopløsning på 1 mg/ml i vand eller PBS. Filtersteriliseres og opbevares ved 4°C i mørke). Lad hærde og inkuber pladen natten over ved 27°C. Neutralralt rødt vil farve sunde celler, og plakkerne vil fremstå som klare områder, ca. 0,5 – 3 mm i diameter på en hvid baggrund. Da neutralrødt er et vitalt farvestof, er det vigtigt at farve, mens cellemonolaget er sundt, dvs. 4 til 7 dage efter infektionen.

Plaqueoprensning fra virusoplag

For at sikre en korrekt isolering er det bedst, at plaques plukkes fra plader, der indeholder færre end 50 plaques. Plader flere fortyndinger af virusset for at sikre, at der opnås et tilstrækkeligt lavt antal plaques. Plakater kan opsamles ved hjælp af sterile mikropipettespidser (1 000 µl) eller mikrokapillærrør.

Amplificering af virus fra opsamling af plakater

  1. Mærk pladen under plakaten med en markør. Ved hjælp af en steril pipettespids fjernes en agaroseprop direkte over plakaten. Der tages mellem 10 og 100 plaques på denne måde.
  2. Placér hver agaroseprop i et separat mikrocentrifugerør indeholdende 1 ml vævskulturmedium. Eluér viruspartiklerne ud af agarosen ved at rotere røret natten over ved 4 °C.
  3. Forsæt 200 µl af hver plakoptagelse til separate brønde i en 12-hullers vævskulturplade, der er udsået med 2 x 10 5 celler pr. brønd i 1 ml frisk TNM-FH-medie. Inkubér pladerne i 3 dage ved 27 °C.
  4. Virusovernatanten af denne passage-én-stock kan opsamles og centrifugeres i 5 min. ved 1.000 x g ved 4 °C for at fjerne debris. Opbevares ved 4 °C.
  5. Sæt en 100 mm vævskulturplade med 5 x 10 6 celler for hvert plaktisolat. Lad cellerne sætte sig fast, og udskift mediet med 10 ml frisk TNM-FH-medie.
  6. Tilsæt 200 µl af passage-én-stammen til 100 mm-pladen, og inkuberes ved 27 °C i 4 dage. Gem de resterende 800 µl passage-one-stock ved 4 °C som backup.
  7. Høst den virale supernatant, og centrifuger for at fjerne debris. Bestem titeren af denne passage-two-stock. Hvis titer er fortsat under 2 x 10 8 pfu/ml, fortsættes med Baculovirusforstærkning.

By: adminPosted on

Skriv et svar

Din e-mailadresse vil ikke blive publiceret.