Mitokondriel biogenese og metabolisk hyperaktivering begrænser anvendelsen af MTT-assay i vurderingen af stråleinduceret væksthæmning estimering af stråleinduceret væksthæmning

Ændringer i stråleinduceret metabolisk levedygtighed korrelerer ikke med væksthæmning

Ved undersøgelse af stråleinduceret væksthæmning i forskellige cellelinjer ved hjælp af MTT-assay og tælling af celletal, fandt vi ud af, at resultaterne fra metabolisk levedygtighedsbaserede assays ikke korrelerer med det faktiske antal celler på forskellige tidspunkter efter strålingseksponering. Da MTT-assayet er meget anvendt på grund af det faktum, at det reelt repræsenterer det levedygtige celletal i en given prøve2,3,4 . Vi undersøgte dette assay ved at sammenligne MTT-værdierne med celletallet. Eksponentielt voksende celler blev udsat for ioniserende stråling for at analysere væksthæmning samt metabolisk levedygtighed ved at tælle henholdsvis antallet af celler og reduktionen af tetrzoliumsalt til formazan (klassisk MTT-assay; her anvendt som MTT-indeks). Først og fremmest blev cellerne udsat for forskellige doser ioniserende stråling (2, 3, 5 og 7 Gy) for at observere de strålingsdosisafhængige ændringer og sammenhængen mellem celletal og metabolisk levedygtighed. Mængden af dannet formazan (dvs. MTT-indekset) 48 timer efter bestråling i alle tre cellelinjer (A549, MDA-MB-231 og HeLa) viste en reduktion på 20 til 35 % (ved 5 Gy og 7 Gy; supplerende fig. 1Ai til Ci) sammenlignet med ubestrålede celler, mens faldet i antallet af celler lå i intervallet 70 til 90 % (supplerende fig. 1Ai til Ci), mens faldet i antallet af celler var i intervallet 70 til 90 % (supplerende fig. 1Aii til Cii), hvilket klart indikerer en manglende korrelation mellem metabolisk levedygtighed (MTT-indeks) og væksthæmning (celletal) ved alle strålingsdoser; de to analyserede strålingsresponsparametre.

For yderligere at undersøge generaliteten af denne observation undersøgte vi forholdet mellem ændringer i celleantal (væksthæmning) og MTT-indeks (metabolisk levedygtighed) i 7 ikke-tumorogene og tumorogene cellelinjer (NIH/3T3, Raw 264.7, HEK-293, HeLa, A549, MCF-7 og MDA-MB-231) ved en enkelt dosis (5 Gy), som inducerede næsten 50 % væksthæmning i de tre testede celler (Supplerende figur 1). 24 timer efter bestråling viste alle de evaluerede cellelinjer enten samme værdi som kontrollen eller en stigning i værdien af MTT-indekset (fig. 1Ai til Gi), undtagen Raw 264.7 (fig. 1Bi), som er relativt strålingsfølsom. På den anden side blev der konstateret et betydeligt fald i antallet af celler under disse betingelser (fig. 1Aii til Gii). 48 timer efter bestråling var celletallet betydeligt lavere, fra 43 % (MDA-MB-231, Fig. 1Gii) til 76 % (Raw 264.7, Fig. 1Bii) sammenlignet med kontrol, mens MTT-indeksværdierne kun viste en reduktion på henholdsvis 10 % til 37 %, med det maksimale i Raw264.7-cellelinjen (Fig. 1Bi). Når værdierne af MTT-indekset (Δ OD) blev normaliseret med det tilsvarende celletal, viste det 1,4 til 3 gange (i forskellige cellelinjer) øget metabolisk levedygtighed pr. celle (afledte oplysninger) ved 24 og 48 timer, som yderligere blev reduceret ved 48 timer i de fleste cellelinjer undtagen Raw264.7, NIH/3T3 og HeLa-celler, men forbliver signifikant højere end den respektive kontrol (Fig. 1Aiii til Giiiii). Disse observationer viser klart, at celletallet, som er det sande mål for stråleinduceret væksthæmning og/eller cytotoksicitet, ikke korrelerer med den metaboliske levedygtighedsbaserede (MTT) test med høj gennemløbskapacitet, der er almindeligt anvendt til hurtig vurdering af strålingsrespons, hvilket synes at skyldes den stråleinducerede forbedrede metaboliske levedygtighed (Fig. 1Aiii til Giii) af eksponerede celler.

Stråleeksponering øger den metaboliske levedygtighed ved at øge mitokondriemassen

Den øgede metaboliske levedygtighed i stråleeksponerede celler kan enten skyldes hyperaktive mitokondrier eller øget mitokondriemasse, fordi omdannelse af MTT til formazan hovedsageligt sker i mitokondrier7,8,9,10. Ioniserende stråling er kendt for at inducere mitokondriel masse og funktion i eksponerede celler20,21. Derfor undersøgte vi ved hjælp af flowcytometri, om øget mitokondriel masse er ansvarlig for øget MTT-indeks i stråleudsatte celler. I overensstemmelse med tidligere observationer fandt vi, at den gennemsnitlige mitokondrielle masse pr. celle var signifikant forøget med næsten 1,4 gange i MCF-7 (minimum, fig. 2Fi) til 4 gange i Raw 264.7 (maksimum, fig. 2Bi) 24 og 48 timer efter strålingseksponering (fig. 2Ai til Gi). Samtidig blev der i bestrålede celler også observeret en øget produktion af formazan pr. celle på de respektive tidspunkter, som blev kvantificeret under lignende forsøgsbetingelser (Fig. 2Aii til Gii). De mikroskopiske billeder 24 timer efter strålingseksponering viser også en synligt øget formazanaflejring i bestrålede celler i forhold til kontrolcellerne (fig. 2Aiii til Giii). De formazanholdige organer (mitokondrier) i kontrolcellerne er mindre intense i farven, sparsomt og ensartet fordelt i cytoplasmaet, mens de i de stråleudsatte celler var mørke i farven og samlet i det perinukleære område (fig. 2Aiii til Giiiii). Disse mikroskopiske billeder giver visuelle og understøttende beviser for det højere MTT-indeks eller den øgede metaboliske levedygtighed pr. celle i de bestrålede celler. Endvidere validerer det, hvordan et reduceret antal bestrålede overlevende celler kan producere en meget større mængde formazan (farvetæthed) pr. celle end respektive ubehandlede kontrolceller, hvilket resulterer i en forkert fortolkning af data.

Stråling øger den metaboliske levedygtighed ved at inducere mitokondriel biogenese

Mitokondrier er det vigtigste sted, hvor MTT reduceres til formazan7,8,9,10, og derfor kan en forøgelse af mitokondriel masse øge den metaboliske levedygtighed. Den øgede mitokondrielle masse i bestrålede celler kan opnås af to årsager: For det første inducerer ioniserende stråling G2/M-blokering22,23 celler, der er arresteret i G2-fasen, vil have et større antal mitokondrier22,23,24 , som kan reducere mere MTT til formazan i bestrålede celler. For det andet er ioniserende stråling kendt for at inducere mitokondriel biogenese20,21 , hvilket resulterer i øget mitokondriel masse. For at teste, om strålingsinduceret G2/M-stop eller mitokondriel biogenese eller begge dele er ansvarlige for øget mitokondriel masse pr. celle i bestrålede celler, undersøgte vi begge hypoteser sekventielt. Da strålingsinduceret øget mitokondriemasse (Fig. 2Ai til Gi) blev observeret i alle cellelinjerne, blev kun HeLa- og MDA-MB-231-celler tilfældigt udvalgt til at forstå de mekanismer, der ligger til grund for strålingsinduceret øget metabolisk levedygtighed.

Cellecyklusfordelingen blev udført 24 og 48 timer efter stråling. Ved 24 timer blev der fundet 17 og 6 % overskydende cellepopulationer i G2/M-fraktionen af cellecyklusen i henholdsvis HeLa og MDA-MB-231-celler. Blokeringen er imidlertid helt ophævet efter 48 timer (Fig. 3A), hvilket tyder på, at strålingsinduceret cellecyklusstop kan være delvis medvirkende til den øgede mitokondrielle masse efter 24 timer, men ikke efter 48 timer. Det er også vigtigt at bemærke, at næsten 17 % øget antal celler i G2/M-fasen ikke kan medføre 1,9 gange (hvilket er 90 % højt) ændring i mitokondriemassen og 1,5 gange ændring i MTT-reduktion til formazan ved 24 timer i HeLa-celler (fig. 2Di og Dii). Selv om cellecyklusblokeringen blev fuldstændig ophævet ved 48 timer, forblev den mitokondrielle masse og den forbedrede metaboliske levedygtighed dog betydeligt højere end de respektive kontroller. Disse observationer støtter ikke den påstand, at strålingsinduceret forbedret metabolisk levedygtighed skyldes cellecyklusstop medieret øget mitokondriemasse, som tidligere rapporteret i tilfælde af behandling med polyfenolforbindelser18,25.

For yderligere at teste hypotesen om, at den stråleinducerede hypermetaboliske aktivitet, som korrelerer med øget mitokondriel masse i eksponerede celler (fig. 2Ai til Gi), skyldes stråleinduceret mitokondriel biogenese, analyserede vi mtDNA-kopienummeret i kontrolceller og stråleeksponerede celler. Kopiantalet af Leu t-RNA-genet blev målt for det mitokondriegenomkodede mtDNA-kopiantal og normaliseret med nuklear pol-gamma ved hjælp af en semikvantitativ PCR-metode. Både HeLa- og MDA-MB-231-celler viste 18 % og 31 % øget mtDNA-kopiantal efter 24 timers strålingseksponering, som yderligere stiger op til 138 % i HeLa og fortsat er 21 % højere i MDA-MB-231 end kontrolceller efter 48 timer (fig. 3B). Endvidere undersøgte vi det tidsafhængige ekspressionsniveau af PGC-1α (Peroxisome proliferator-aktiveret receptor gamma coactivator 1-alpha) og TFAM (Mitochondrial Transcription Factor A) proteiner ved hjælp af Western blot. Disse to proteiner er de vigtigste regulatorer af mitokondriel biogenese og vedligeholdelse i celler26,27,28. Interessant nok blev der observeret en tidsafhængig stigning i både PGC-1α- og TFAM-ekspressionen (Fig. 3C) i celler (HeLa og MDA-MB-231), der blev udsat for stråling, hvilket korrelerer med en øget mitokondrielmasse på 24 timers tidspunkt (Fig. 2Di og Gi). Endvidere kontrollerede vi, om den øgede mitokondrielle masse er funktionel og har øget ekspression af proteinet SDH-A, som er det primære reducerende enzym for MTT til Formazan7,8,9,10. Proteinniveauerne af SDH-A blev også fundet forøget efter 8 og 24 timers strålingseksponering (fig. 3C), hvilket korrelerer med øget MTT-indeks eller øget metabolisk levedygtighed i HeLa- og MDA-MB-231-celler (fig. 1 og 2). SDH-A-niveauerne blev også fundet signifikant forhøjet i andre cellelinjer (data ikke vist). For yderligere at validere hypotesen resulterer strålingsinduceret mitokondriel biogenese i øget metabolisk levedygtighed; vi inhiberede den mitokondrielle biogenese ved hjælp af chloramphenicol29,30. Vi fandt, at chloramphenicol i en ikke-toksisk koncentration reducerede den strålingsinducerede mitokondriebiogenese betydeligt i begge cellelinjer (Fig. 3D). da MTT og vækstkinetik (Fig. 3E og F) blev udført i celler behandlet med chloramphenicol før strålingseksponering, viste det signifikant lavere formazandannelse end stråling alene (Fig. 3E), hvilket tyder på, at strålingsinduceret øget metabolisk levedygtighed hovedsagelig skyldes mitokondriebiogenese. Forskellen mellem den stråleinducerede væksthæmningskurve opnået ved MTT-analyse og celletælling er fortsat kun 8 % i chloramphenicolbehandlede celler (Fig. 3E og F), som var 25 % og 33 % i henholdsvis HeLa- og MDA-MB-231-celler (Fig. 1Di-ii og Gi-ii). Disse resultater underbygger hypotesen om, at strålingsinduceret øge mitokondriel masse og metabolisk levedygtighed kommer fra strålingsinduceret mitokondriel biogenese op til stort omfang, som reguleres af strålingsinduceret PGC-1α og TFAM.

Stråling inducerer hyperaktivering af mitokondrier

I tidligere resultater observerede vi, at ioniserende stråling inducerer den mitokondrielle masse i celler, hvilket synes at være ansvarlig for øget metabolisk levedygtighed (MTT-indeks) i bestrålede celler; det er dog kendt, at stråling også inducerer hyperaktivering af individuelle mitokondrier i bestrålede celler31. For at afgøre, om det forbedrede MTT-indeks kun blev observeret på grund af øget mitokondriel masse eller også på grund af stråleinduceret hyperaktivering af mitokondrier, målte vi ΔΨm (mitokondrielt membranpotentiale, MMP) ved fluorescensmikroskopi med TMRM. Bestrålede celler (efter 24 timer) viste klart røde punktformede mitokondrier, der tyder på høj ΔΨm sammenlignet med kontrolceller (Fig. 4A). Dette resultat blev yderligere valideret ved kvantitativ vurdering af ΔΨm ved hjælp af DiOC6 ved flowcytometri. HeLa-celler viste 2,4 til 2,8 gange øget MMP, mens MDA-MB-231-celler viste 1,3 gange ændringer i strålingsinduceret MMP på begge tidspunkter (fig. 4B). Dette høje mitokondriemembranpotentiale korrelerer med en flerfoldig høj formazandannelse i hver mitokondrion i bestrålede celler (indsat billede i Fig. 2Aiii), hvilket tyder på hyperkompleks II (SDH)-aktivitet (Fig. 2Aii til Gii), sandsynligvis på grund af stråleinduceret øget ΔΨm. Denne observation er i overensstemmelse med tidligere resultater i andre undersøgelser, som tyder på, at kompleks II er mere effektivt til at etablere og opretholde ΔΨm under stressbetingelser32,33. Den øgede ΔΨm som følge af hyperaktivt kompleks II sikrer også øget aktivitet af andre mitokondrielle dehydrogenaser, hvilket kan bidrage til øget formazandannelse ud over SDH.

Succinatdrevet oxidation via kompleks-II (SDH) er blevet fundet med det betydelige bidrag til den øgede mitokondrielle ROS-generering34. Derfor analyserede vi det mitokondrielle superoxidniveau i kontrolceller og bestrålede celler for at teste det faktum, at hypermetabolisk aktive mitokondrier skulle producere flere superoxidradikaler. Celler, der var farvet med MitoSox (mitokondriel ROS-indikator), blev analyseret på flowcytometer. Bestrålede celler viser signifikant øget MitoSox-fluorescens i forhold til deres respektive kontrolceller. Begge cellelinjer viste næsten 1,25 gange en stigning i mitokondriel ROS ved 24 timer, men den steg yderligere til 1,65 gange i HeLa-celler og 1,5 gange i MDA-MB-231-celler ved 48 timer efter strålingseksponering (fig. 4C). Da mitokondriel dehydrogenase SDH er den vigtigste bidragyder til MTT-reduktion7,8,9,10, bekræfter disse resultater observationen af øget ROS er direkte proportional med den øgede SDH-aktivitet34. Disse resultater tyder på, at den øgede mitokondrielle masse består af funktionelt hyperaktive mitokondrier, der reducerer en større mængde MTT i formazan pr. celle i bestrålede prøver.

Stråling inducerer Calciumakkumulering i mitokondrier

Ioniserende stråling forstyrrer den cellulære calciumhomeostase, hvilket fører til øget frigivelse af calcium fra endoplasmatisk retikulum (ER) til cytoplasma, som derefter buffer af funktionelle mitokondrier i cellernes perinukleære region35,36. Ændret calciumhomeostase inducerer også ROS-produktion (reaktive oxygenarter) og mitokondriel biogenese35,36,37.

For at undersøge, om øget metabolisk levedygtighed observeret ved 24 og 48 timer skyldes øgede cytoplasmatiske og mitokondrielle Ca2+-niveauer, blev frit cellulært og mitokondrielt Ca2+ estimeret. Kontrolcellerne og de behandlede celler blev farvet med Fluo-3AM (Ca2+ -indikator) og Rhod-2AM (specifik mitokondriel Ca2+ -indikator)38 på de respektive tidspunkter og analyseret på flowcytometer. Den signifikante stigning i calciumniveauet blev observeret i bestrålede celler, som blev øget med næsten 1,4 gange (40 %) i begge de undersøgte cellelinjer (HeLa og MDA-MB-231), hvilket antydes af øget Fluo-3-fluorescens ved 8 timer, som reduceres marginalt ved 24 timer (fig. 5A). Interessant nok blev der konstateret en endnu mere strålingsinduceret stigning i mitokondriel Ca2+ (2,4 gange i HeLa og 1,6 gange i MDA-MB-231, Fig. 5B). Denne observation blev yderligere verificeret ved at visualisere de farvede celler under fluorescensmikroskop. Der blev observeret celler, der var farvet med Mitotracker Red, Fluo-3AM og Rhod-2AM uafhængigt af hinanden 24 timer efter strålebehandlingen. Fluo-3AM og Rhod-2AM viser begge en stærk perinukleær punktvis fluorescens med samme mønster som vist af mitotracker red i strålingsudsatte tilsvarende celler (fig. 5C), hvilket tyder på, at øget cytoplasmatisk Ca2+ ophobes i mitokondrier. Desuden bekræfter specifikke Ca2+ signaler fra mitokondrier i Rhod-2AM farvede celler denne observation. Interessant nok viste MDA-MB-231-cellerne allerede høj mitokondriel Ca2+ (Rhod-2-AM-farvning) og perinukleær mitokondriel gruppering (Mitotracker Red-farvning) i kontrolcellerne, som stiger yderligere efter bestråling, hvilket kunne være årsagen til, at denne celle viste den laveste stigning i den strålingsinducerede mitokondrielle biogenese og formazandannelse efterfølgende. Vi har i vores tidligere undersøgelse vist, at stråling forårsager ophobning af Ca2+ i mitokondrier, hvilket fører til mitokondriel skade og mitofagi36. Mitokondrier med høj Ca2+ og øget mitokondriemembranpotentiale akkumulerer mere A23187 og viser lysere fluorescens under mikroskopet ved UV-eksponering. Permanent beskadigede mitokondrier viser imidlertid meget høj fluorescens og fremstår som runde kroppe inde i cellen36. For at observere Ca2+-akkumulering i mitokondrier under disse forsøgsbetingelser farvede vi kontrol- og bestrålede HeLa- og MDA-MB-231-celler 24 timer efter eksponeringen (fig. 5C). Bestrålede celler viste også højere ophobning af organer, hvilket indikerer stråleinducerede beskadigede mitokondrier. Bestrålede celler viser højere Mitotracker Red-, Fluo-3AM- og Rhod-2AM-fluorescens i det perinukleære område (fig. 5C), hvor mitokondrier danner et netværk med det endoplasmatiske reticulum (ER) og akkumulerer det meste af den stressinducerede Ca2+-lækage fra ER og beskytter cellerne mod død39. Dette resultat tyder på, at Ca2+, der frigives fra lagre efter strålingseksponering, hovedsageligt akkumuleres i mitokondrier. Det er tidligere rapporteret, at højt Ca2+indhold i mitokondriernes matrix øger SDH-aktiviteten40. Derfor korrelerer vi med, at Ca2+ akkumuleret i mitokondrier øgede SDH-kompleksaktiviteten, hvilket fører til hyperaktive mitokondrier og øget metabolisk levedygtighed i stråleudsatte celler.

Kalciumakkumulering i mitokondrier fører til cellulær hyperaktiv metabolisk tilstand

For yderligere at underbygge Ca2+’s rolle i øget formazandannelse testede vi, om Ca2+-forstyrrelser i celler alene kan øge den metaboliske levedygtighed. For at teste denne påstand blev cellerne behandlet med Ca2+ ionoforen A23187 (2 µM, som øger den cytoplasmatiske Ca2+, det samme som ioniserende stråling) i 1 time og analyserede den metaboliske levedygtighed 4, 8 og 24 timer efter behandlingen. Interessant nok viste celler behandlet med A23187 signifikant øget (1,6 gange) metabolisk levedygtighed pr. celle ved 8 & 24 timer i HeLa og 4 & 8 timer i MDA-MB-231 (Fig. 6A), efter behandling. Disse resultater tyder på, at øget cytoplasmatisk Ca2+ øger den metaboliske levedygtighed ved at øge ophobningen af Ca2+ i mitokondrier (Fig. 5C). Vi undersøgte også, om hæmning af Ca2+-akkumulering i mitokondrier kan hæmme den strålingsinducerede stigning i mitokondriernes masse. Interessant nok fandt vi, at celler behandlet med en inhibitor af mitokondriel Ca2+ uniporter, Ruthenium Red (RuR, som hæmmer ophobning af Ca2+ i mitokondrier), viste en signifikant lav stigning i mitokondrieindholdet (strålingsinduceret) sammenlignet med stråling alene (Fig. 6B). Det er kendt, at øget Ca2+ inducerer mitokondriel biogenese gennem CaMKII (Calmodulin Kinase-II)37,41, som også er et mitokondrielt resident protein, der er kendt for at regulere PGC-1α-ekspression37,41,42. Derfor konkluderer vi, at hæmning af Ca2+-akkumulering i mitokondrier ved hjælp af rutheniumrød reducerede mitokondriemassen, sandsynligvis ved at hæmme den mitokondrielle biogenese. For yderligere at validere, om strålingsinduceret øget cytoplasmatisk Ca2+ og dets ophobning i mitokondrierne fører til øget metabolisk levedygtighed i bestrålede celler, behandlede vi cellerne med BAPTA-AM (en intracellulær calciumchelator) og RuR 30 minutter før bestråling. Chelatering af øget cytoplasmatisk Ca2+ ved hjælp af BAPTA-AM (fig. 6C) og hæmning af ophobning af Ca2+ i mitokondrier ved hjælp af RuR (fig. 6D) ophævede begge den strålingsinducerede øgede metaboliske levedygtighed efter 24 og 48 timers bestråling i HeLa- og MDA-MB-231-celler (fig. 6C og D). Disse resultater tyder på, at strålingsinduceret forstyrrelse i Ca2+ homeostase også spiller en vigtig rolle i hyperaktivering af mitokondrier og øget metabolisk levedygtighed, sandsynligvis opstrøms for mitokondriel biogenese.