Van ‘t Hoff opnåede sit tidligste ry inden for organisk kemi. I 1874 forklarede han fænomenet optisk aktivitet ved at antage, at de kemiske bindinger mellem kulstofatomer og deres naboer var rettet mod hjørnerne af et regelmæssigt tetraeder. Denne tredimensionelle struktur forklarede de isomerer, der findes i naturen. Han deler æren for dette med den franske kemiker Joseph Le Bel, som uafhængigt af hinanden kom på samme idé.
Tre måneder før han fik sin doktorgrad, offentliggjorde Van ‘t Hoff denne teori, som i dag betragtes som grundlaget for stereokemien, først i en hollandsk pamflet i efteråret 1874 og derefter i den følgende maj i en lille fransk bog med titlen La chimie dans l’espace. En tysk oversættelse udkom i 1877, på et tidspunkt, hvor det eneste job, Van ‘t Hoff kunne finde, var på veterinærskolen i Utrecht. I disse tidlige år blev hans teori stort set ignoreret af det videnskabelige samfund, og blev skarpt kritiseret af en fremtrædende kemiker, Hermann Kolbe. Kolbe skrev:
“En Dr. J. H. van ‘t Hoff fra Veterinærskolen i Utrecht har tilsyneladende ingen forkærlighed for nøjagtige kemiske undersøgelser. Han har fundet det mere bekvemt at bestige Pegasus (tilsyneladende lånt fra Veterinærskolen) og i sin ‘La chimie dans l’espace’ proklamere, hvordan han i sin dristige flyvetur til toppen af det kemiske Parnassus syntes at atomerne var arrangeret i det kosmiske rum.”
Omkring 1880 bragte støtte til Van ‘t Hoffs teori fra så betydningsfulde kemikere som Johannes Wislicenus og Viktor Meyer imidlertid anerkendelse.
I 1884 offentliggjorde Van ‘t Hoff sin forskning om kemisk kinetik med titlen Études de Dynamique chimique (“Studier i kemisk dynamik”), hvori han beskrev en ny metode til at bestemme rækkefølgen af en reaktion ved hjælp af grafik og anvendte termodynamikkens love på kemiske ligevægte. Han introducerede også det moderne begreb kemisk affinitet. I 1886 påviste han en lighed mellem opførslen af fortyndede opløsninger og gasser. I 1887 grundlagde han sammen med den tyske kemiker Wilhelm Ostwald et indflydelsesrigt videnskabeligt tidsskrift med navnet Zeitschrift für physikalische Chemie (“Journal of Physical Chemistry”). Han arbejdede på Svante Arrhenius’ teori om elektrolytternes dissociation og gav i 1889 en fysisk begrundelse for Arrhenius-ligningen. I 1896 blev han professor ved det preussiske videnskabsakademi i Berlin. Hans undersøgelser af saltforekomsterne ved Stassfurt var et vigtigt bidrag til Preussens kemiske industri.
Van ‘t Hoff blev lektor i kemi og fysik ved Veterinærhøjskolen i Utrecht. Derefter arbejdede han som professor i kemi, mineralogi og geologi ved universitetet i Amsterdam i næsten 18 år, før han til sidst blev formand for det kemiske institut. I 1896 flyttede Van ‘t Hoff til Tyskland, hvor han afsluttede sin karriere ved universitetet i Berlin i 1911. I 1901 modtog han den første Nobelpris i kemi for sit arbejde med opløsninger. Hans arbejde viste, at meget fortyndede opløsninger følger matematiske love, der minder meget om de love, der beskriver gassers adfærd.