Når en biologisk prøve kryokonserveres, bremses molekylær bevægelse og cellulære processer til glasovergangspunktet, hvor al aktivitet stopper, og celler, væv og endda hele organismer bevares i årevis. Derfor er det ikke overraskende, at kryokonservering er kernen i de fleste moderne biobanker.
Men selv om konceptet med nedfrysning er ligetil, er den fysiske proces ret kompleks. Den måde, hvorpå frysning eller vitrificering foregår, kan have en dramatisk indvirkning på cellernes levedygtighed og prøvens kvalitet, når de returneres til varmere temperaturer.
Vi vil udforske isens fysiske egenskaber og de vigtigste begivenheder i forbindelse med frysning og optøning af prøver (som er lige så vigtig som afkøling) i en række blogindlæg, der går dybere ned i fryseprocessen. I dette første indlæg starter vi ved begyndelsen og ser på frysningens første trin, kernedannelse.
Rent vand, der er afkølet under frysepunktet, kan forblive en superkølet væske, indtil det bliver forstyrret. (Videoen nedenfor giver en god illustration af dette punkt og er et fantastisk videnskabeligt eksperiment, som man kan prøve med børnene derhjemme!)
I videoen giver det at slå på en vandflaske et sted, hvor iskrystaller kan dannes, eller med andre ord et sted for kernedannelse. Kernedannelse er en proces, hvor molekylerne i en væske begynder at samle sig i små klynger, der arrangerer sig på en måde, som vil definere krystalstrukturen i det faste stof. Der findes to typer af kernedannelse:
- Heterogen kernedannelse, som opstår, når is begynder at danne sig omkring et kernedannelsessted, f.eks. en fysisk forstyrrelse, en urenhed (f.eks. salt) i væsken eller en uregelmæssighed i en beholder. Da biologiske prøver aldrig er rent vand, oplever de altid heterogen kernedannelse.
- Homogen kernedannelse, som opstår, når der dannes is uden noget foruddefineret kernedannelsessted. Rent vand vil fryse ved ca. -39 °C i fravær af kernedannelsessteder. I praksis ses homogen kernedannelse dog ikke ofte på grund af sjældenheden af helt rent vand.
Ifølge en gennemgang i tidsskriftet Cryobiology er “kernedannelse af is den mest significante ukontrollerede variabel i konventionel kryokonservering, der fører til variation fra prøve til prøve i cellegenvinding, levedygtighed og funktion.” Forfatterne anbefaler at kontrollere kernedannelsesprocessen og opregner flere frysemetoder, hvoraf mange er almindeligt anvendte til IVF-applikationer:
- Seeding: Indførelse af en ekstern iskrystal for at fremme kernedannelse ved en bestemt temperatur. For at minimere risikoen for kontaminering foretages seedning nu ved at generere et koldt punkt på beholderens yderside, f.eks. en kold pincet på siden af et sugerør.
- Kemiske nukleanter: Iskrystaller, der danner iskerne, indgår i prøvemediet. Kemiske nukleanter giver mulighed for en bred standardisering på tværs af prøvetyperne og er et aktivt forskningsområde.
- Elektrofrostning: Der anvendes højspændingselektricitet til at fremkalde isdannelse.
- Mekaniske metoder: Rystning, bankning eller anvendelse af ultralyd kan være effektive til kernedannelse, men er vanskelige at standardisere.
- Stødkøling/kontrolleret frysning: Udsættelse af prøven for et hurtigt sæt af temperaturramper kan fremme kernedannelse. Det er det, som en fryser med kontrolleret hastighed gør ved at føre prøverne gennem kernedannelsesprocessen.
- Trykforskydning: Kernedannelse kan fremkaldes ved at sætte prøven under tryk, sænke temperaturen og derefter slippe trykket.
For en fremragende introduktion til egenskaberne ved isdannelse i biologiske systemer og mere om processen med kernedannelse kan du læse kapitel et i den grundlæggende tekst fra 2004 “Life in the Frozen State”, en stærkt anbefalet læsning for alle, der er interesseret i at vide mere om disse processer i detaljer.