En af de egenskaber ved enzymer, der gør dem så vigtige som diagnostiske og forskningsmæssige værktøjer, er den specificitet, de udviser i forhold til de reaktioner, de katalyserer. Nogle få enzymer udviser absolut specificitet; det vil sige, at de kun katalyserer én bestemt reaktion. Andre enzymer vil være specifikke for en bestemt type kemisk binding eller funktionel gruppe. Generelt er der fire forskellige typer specificitet:
- Absolute specificitet – enzymet vil kun katalysere én reaktion.
- Gruppespecificitet – enzymet vil kun virke på molekyler, der har specifikke funktionelle grupper, f.eks. amino-, fosfat- og methylgrupper.
- Linkage-specificitet – enzymet vil virke på en bestemt type kemisk binding uanset resten af den molekylære struktur.
- Stereokemisk specificitet – enzymet vil virke på en bestemt sterisk eller optisk isomer.
Og selv om enzymer udviser store grader af specificitet, kan cofaktorer tjene mange apoenzymer. F.eks. er nikotinamid-adenin-dinukleotid (NAD) et coenzym for et stort antal dehydrogenase-reaktioner, hvor det fungerer som hydrogenacceptor. Blandt dem er alkoholdehydrogenase-, malatdehydrogenase- og laktatdehydrogenasereaktionerne.