Immunohistokemi (IHC) er en effektiv mikroskopibaseret teknik til at visualisere cellulære komponenter, f.eks. proteiner eller andre makromolekyler i vævsprøver. Styrken ved IHC er det intuitive visuelle output, der afslører eksistensen og lokaliseringen af målproteinet i forbindelse med forskellige celletyper, biologiske tilstande og/eller subcellulær lokalisering i komplekse væv.
IHC-teknikken blev opfundet i 1940’erne (Coons, Creech, & Jones, 1941) og anvendes rutinemæssigt som et vigtigt redskab inden for sundhedspleje og patologi, f.eks. til diagnostiske formål eller til at stratificere patienter med henblik på optimerede behandlingsregimer. IHC anvendes også i vid udstrækning inden for forskning, hvor molekyler af interesse analyseres med henblik på at undersøge deres rolle i både sunde og syge celler og væv på molekylært, cellulært eller vævsniveau. Der er mange forskellige måder at visualisere mål i væv på ved hjælp af IHC eller IHC-baserede metoder, og der findes mange protokoller til forskellige applikationer og assays. Selv om IHC generelt er en robust og etableret metode, skal nye assays ofte optimeres omhyggeligt afhængigt af vævet eller af egenskaberne ved målproteinet, bindemiddelmolekylet og/eller reporter-systemet. Mange års teknisk udvikling og den enormt øgede tilgængelighed af specifikke bindingsmolekyler har i høj grad forbedret IHC’s anvendelighed og anvendelsesområder. Fremskridtene inden for IHC-baserede teknikker og reagenser har givet forskere og sundhedsplejersker mulighed for mere præcise værktøjer, analyser og biomarkører. Desuden har de tekniske fremskridt gjort det muligt at foretage f.eks. meget følsom samtidig påvisning af flere proteiner i den samme prøve og påvisning af protein-protein-interaktioner (se Proximity Ligation Assay).
Den klassiske IHC-assay er illustreret i figur 1 og indebærer påvisning af epitoper udtrykt af et enkelt protein-mål i en vævsprøve ved hjælp af et “primært antistof”, der er i stand til at binde disse epitoper med høj specificitet. Efter bindingen mellem epitop og antistof tilsættes et “sekundært antistof”, der er i stand til at binde det primære antistof med høj specificitet. Det sekundære antistof er koblet til et reportermolekyle, og efter antistof-antistof-bindingen tilsættes et kemisk substrat, som reagerer med reportermolekylet for at frembringe et farvet bundfald på det sted, hvor hele epitop-antistofkomplekset befinder sig.
Figur 1. Det grundlæggende princip for immunohistokemi.
I den skematiske illustration (figur 1) farves et formalinfikseret paraffinindlejret vævsafsnit ved hjælp af et primært antistof rettet mod et specifikt proteinmål. En opløsning indeholdende det primære antistof tilsættes til vævsafsnittet, og antistofferne får tid til at finde og binde sig til deres mål. Efter dette trin vaskes ubundne og overskydende antistoffer væk, hvorefter det sekundære antistof tilsættes. Det sekundære antistof, som bærer et linkermolekyle med peberrodsperoxidase (HRP)-enzymer, får også tid til at binde sig til det primære antistof, hvorefter der igen vaskes. Herefter tilsættes 3,3′ diaminobenzidin (DAB). HRP-enzymet omdanner DAB-substratet til et brunligt bundfald, der aflejres i vævet på reaktionsstedet og dermed giver en visuel repræsentation af, hvor det primære antistof først har bundet sit mål.
Teknologi
Vævsforberedelse
Vævet spiller en central rolle i forsøget, og det er vigtigt, at det behandles, så epitoper og den korrekte morfologi bevares. Den mest almindelige behandling til IHC er at forberede formalinfikserede paraffinindlejrede (FFPE) vævsblokke. Formålet med formalinfiksering er at skabe kemisk krydsbinding af proteiner i vævet. Dette afslutter alle cellulære processer og fastfryser de cellulære komponenter på det sted og i den konformation, de befandt sig på tidspunktet for fikseringen, og forhindrer også nedbrydning. Efter passende fiksering behandles vævet yderligere og indlejres til sidst i paraffinblokke, som derefter skæres i tynde skiver (normalt 4-10 µm) ved hjælp af en mikrotom. Snittene overføres til glasplader og får lov til at hæfte inden videre behandling.
Der anvendes undertiden andre metoder til fiksering end formalin. Disse omfatter andre typer aldehyder eller anvendelse af forskellige alkoholopløsninger. Det bedste valg af fiksationsmiddel afhænger i høj grad af analysen. Et almindeligt alternativ til FFPE er at forberede frosne vævsprøver. I dette tilfælde indlejres vævet i et kryobeskyttende medium og nedfryses, og fiksering foretages efter snitningen. Frosne væv sektioneres i kryostater og har den fordel, at der er kort behandlingstid og bedre bevarelse af følsomme epitoper, men kan ofte være ringere end FFPE-væv med hensyn til bevarelse af histologisk morfologi.
Antigen (epitope) retrieval
En bekymring i forbindelse med tværbindende fiksationsmidler som formalin eller for lang tid i fiksationsmediet er maskering af epitoper, som kan forhindre det primære antistof i at binde til sit mål. Især med FFPE-prøver er der ofte behov for at vende noget af den kemiske krydsbinding tilbage og “hente” epitoperne frem, inden man går videre til selve IHC-undersøgelsen. Der findes flere protokoller til fjernelse af antigener, og de vigtigste strategier omfatter behandling af vævsglasset med varme, fordøjelsesenzymer, detergenter eller kombinationer heraf. Den mest almindelige metode til antigenretrieval i FFPE-prøver er at trykkoge vævsglassene i en sur citratbuffer i ca. 15-20 minutter.
Antistofbinding
Kvaliteten og specificiteten af bindingsmolekylet er afgørende for enhver IHC-baseret teknik, og valget af bindemiddel kan direkte påvirke resultatet, pålideligheden og muligvis også fortolkningen af assayet. Antistoffer er langt den mest almindelige type bindingsmolekyle, der anvendes til IHC, og selv om de fleste antistoffer er i stand til at detektere det korrekte molekyle af interesse på passende vis, kan de også variere meget i deres specificitet for deres tilsigtede mål. Antistoffer med høj specificitet er derfor mere pålidelige ved fortolkning af “on-target”-binding, da de kun producerer lidt eller ingen “off-target”-binding eller “baggrund”. Antistoffer, der er mindre specifikke, kan producere mere off-target-binding, og den deraf følgende baggrund vil muligvis forstyrre den korrekte fortolkning af de ægte on-target-signaler. Der findes to hovedtyper af antistoffer: polyklonale antistoffer, som er en heterogen blanding af antistoffer, der binder forskellige epitoper på målet, og monoklonale antistoffer, som alle binder den samme epitop. Polyklonale antistoffer er ofte meget potente på grund af deres evne til at detektere og binde flere epitoper på det samme mål. De epitoper, de binder, er imidlertid ofte dårligt definerede, og med flere og varierende epitopspecificiteter følger en øget sandsynlighed for bindingsbegivenheder uden for målet og baggrundsstøj. Styrken af polyklonale antistoffer kan imidlertid være en fordel, da koncentrationen af bindingsbegivenheder omkring målmolekylet normalt opvejer den potentielle baggrundsstøj. En ulempe er, at polyklonale antistoffer normalt er begrænsede ressourcer, da de stammer fra dyresera. Monoklonale antistoffer har derimod større kontinuitet, da de kan fremstilles i hybridomcellelinjer. Monoklonale antistoffer er også ofte veldefinerede med hensyn til epitopbinding, men kan stadig give resultater, der er vanskelige at fortolke, hvis specificiteten er lav, eller hvis målenpitopet er til stede i ringe mængde.
Der er behov for omhyggelig optimering og titrering af antistofkoncentrationen for hvert enkelt assay, da resultatet ikke kun afhænger af antistoffets specificitet og affinitet for målet, men også af koncentrationen og tilgængeligheden af on-target- og potentielle off-target-epitoper, der er til stede i prøven. Hvis der tilsættes for mange antistoffer til prøven, øges antallet af mulige off-target-bindingsbegivenheder med lav affinitet, når on-target-epitopen(erne) er mættet med bindemidler. Ved at sænke antistofkoncentrationen bliver off-target-bindingsbegivenheder sjældnere, da de normalt har lavere affinitet end on-target-bindingsbegivenheder. Risikoen ved at forsøge at reducere baggrunden ved brug af et antistof med lav affinitet er, at on-target-signalerne samtidig svækkes i en sådan grad, at de giver et falsk negativt resultat.
Andre typer bindermolekyler, der undertiden anvendes i IHC-baserede teknikker, omfatter affibodier, peptider, antistoffragmenter eller andre små molekyler.
Detektionssystemer
Hele formålet med at udføre IHC er at opnå en visuel repræsentation af, hvor målet kan findes i det eksperimentelle væv, og fortrinsvis også at få oplysninger om målets ekspressionsmønster blandt heterogene cellepopulationer og/eller subcellulære lokaliseringer. Dette er illustreret i figur 2, som viser, hvordan forskellige antistoffer anvendes til at visualisere forskellige celle- eller vævskompartmenter i et komplekst væv. For at visualisere interaktionen mellem mål og antistof er der behov for en form for detektionssystem, der producerer et observerbart farvestof eller signal. Den mest almindelige metode til at indføre et detektionssystem i forsøget er at anvende et sekundært antistof, der bærer et forudbundet reportermolekyle, dvs. et enzym eller en fluorofore. Sekundære antistoffer er normalt specifikt rettet mod antistofmolekyler fra en anden dyreart. Hvis det primære antistof f.eks. er opdrættet i en kanin, skal det sekundære antistof være opdrættet i et andet dyr og specifikt rettet mod kaninantistoffer.
| Esophagus | Forstørrelse | |||
|---|---|---|---|---|
| Hematoxylinfarvning | Ingen antistoffarvning | |||
| TP63 CAB000083 |
Kernefarvning | |||
| EGFR CAB000035 |
Membranøs farvning | |||
| G6PD HPA000247 |
Cytoplasmafarvning | |||
| LAMB2 (Laminin) CAB000053 |
Bindevæv |
Figur 2. Visualisering af forskellige proteinmål i komplekse væv. Den højre kolonne viser en forstørrelse af de tilsvarende billeder i den venstre kolonne.
I I IHC-billedet (figur 2) giver på hinanden følgende sektioner af menneskelig spiserør farvet med fire forskellige antistoffer mulighed for direkte sammenligning af forskellige proteinekspressionsmønstre i vævet og i subcellulære kompartmenter. De øverste billeder er kun modfarvet med hæmatoxylin til sammenligning. Antistoffet p63 farvelægger cellekerner i en population af celler, der befinder sig i den basale del af øsofageepitelet. EGFR-antistoffet (Epidermal growth factor receptor) ser ud til at farve den samme cellepopulation som p63, men farver cellemembraner i stedet for cellekerner. G6PD-antistoffet (Glucose-6-phosphatdehydrogenase) farvelægger cytoplasmaet i et bredere repertoire af øsofageale epitelceller og også celler i bindevævet. Laminin (LAMB2)-antistoffet farvelægger kun celler og strukturer i det bindevæv, der ligger under spiserøret.
For FFPE-vævsprøver er den mest almindelige detektionsmetode at anvende enzymatiske reaktioner til at generere et farvet præcipitat på det sted, hvor antistoffet bindes. De sekundære antistoffer bærer derefter et enzym, f.eks. peberrodsperoxidase (HRP) eller alkalisk fosfatase (AP), som er i stand til at omdanne chromogener som 3,3′ diaminobenzidin (DAB) eller 5-bromo-4-chlor-3-indolylphosphat/ p-nitroblue tetrazoliumchlorid (BCIP/NBT) til brune eller blålige udfældninger, der aflejres i vævet på reaktionsstedet. Chromogene farvestoffer kan observeres i lysmikroskopi og er normalt meget stabile over lange perioder, hvilket er en fordel, hvis forsøget skal arkiveres eller gennemgås på et senere tidspunkt.
Til frosne vævssnit er det mere almindeligt at anvende fluorforbundne sekundære antistoffer, der udsender en bestemt farve (normalt grøn, rød eller blå), når de exciteres af de korrekte bølgelængder af lys. Desuden er fluorophorer normalt ikke stabile i lange perioder. Fordelen ved at anvende fluorophorer er imidlertid, at de giver en nem metode til at udføre dobbeltmærkningseksperimenter, hvor flere antistoffer mod flere mål analyseres i den samme prøve. De sekundære antistoffer skal være målrettet mod forskellige primære antistoffer og skal også være koblet til forskellige fluorophorer. De forskellige sekundære antistoffer observeres derefter hver for sig ved at excitere dem sekventielt med forskellige bølgelængder af lys. Disse forskellige excitationsresultater gemmes som separate billeder (eller farvekanaler) og kan senere overlejres for at udlede proteinkolokaliseringer osv.
Anvendelse af reporterbærende sekundære antistoffer til detektion er i sig selv et forstærkningstrin, da flere sekundære antistoffer er i stand til at binde et enkelt primært antistof, men undertiden er der behov for yderligere forstærkningstrin for at øge signalet og forsøgets følsomhed. I sådanne tilfælde kan det sekundære antistof i stedet være forsynet med “linkermolekyler”, f.eks. biotinpolymerer, som kan rekruttere et større antal reportermolekyler i efterfølgende trin. Denne strategi til forstærkning af signalerne er nyttig for både enzymatiske og fluorescerende detektionsmetoder.
Kontrastfarvning
Immunohistokemisk farvning ved hjælp af chromogener har ofte fordel af at få påført en kontrastfarve, der forstærker kontrasten og letter observationen af histologiske træk. Den mest almindelige type modfarve, der anvendes til FFPE-prøver, er hæmatoxylin, der farvelægger cellulært cytoplasma med en bleg blålig farve og farvelægger cellekerner i en mørkere blålig nuance. Fluorescerende farvninger modfarves normalt ikke med hæmatoxylin, da detektionsmetoden ikke er baseret på lysmikroskopi. I stedet er den mest almindelige måde at opnå modfarvning for fluorescens på at mærke cellekerner ved at tilsætte fluorescerende farvestoffer, der binder nukleinsyrer. Efter den egentlige immunhistokemiske reaktion er de eneste resterende trin at dække og forsegle prøven med henblik på beskyttelse og langtidsopbevaring. Den mest almindelige måde er at “lime” dækglasset til prøven ved hjælp af kommercielt tilgængelige specialfremstillede harpikser.
Specifikke eksempler
IHC anvendes i vid udstrækning i både forskning og klinisk praksis. Human Protein Atlas-projektet (HPA) er et godt eksempel på, hvordan IHC med højt gennemløb anvendes til at opnå kortlægning i stor skala af det menneskelige proteom i et væld af væv, kræftformer og celler. I HPA-projektet gør en strømlinet intern produktionskæde for antistoffer i stor skala det muligt at generere specifikke antistoffer, som efter at have gennemgået grundlæggende karakteriserings- og valideringsordninger anvendes til systematisk farvning af vævsmikroarrays med hundredvis af vævskerner inden for et enkelt forsøg. Det IHC-system, som HPA anvender, er i høj grad baseret på standardisering af protokoller og automatisering ved hjælp af maskiner, men vurderingen af den optimale titrering for hvert antistof foretages manuelt, før antistoffet godkendes til farvning af det fulde sæt af væv. Hver farvet vævskerne annoteres med hensyn til immunhistokemisk farvning i væv og celletyper og offentliggøres derefter som et billede i høj opløsning på webportalen, så alle frit kan se det.
I klinisk praksis anvendes IHC hovedsagelig inden for patologien til at hjælpe lægerne med at vurdere vævsprøver med hensyn til raske og/eller syge tilstande, til at stille diagnoser og til at definere den molekylære subtype af forskellige kræfttyper. Et specifikt eksempel på, hvor IHC anvendes diagnostisk, er, når patologer får forelagt en prøve af en metastatisk tumor, og vævets oprindelse af den primære tumor er ukendt. I disse tilfælde bruger patologerne et panel af forskellige antistoffer, der er rettet mod vævsspecifikke proteiner, f.eks. prostataspecifikt antigen for prostatakræft, eller østrogenreceptor for gynækologiske kræftformer eller cytokeratin 20 for gastrointestinale kræftformer (Gremel et al., 2014). Når der er foretaget en bred klassificering, anvendes yderligere vævsspecifikke antistoffer til yderligere at fastlægge oprindelsen af den primære tumor. Disse oplysninger er nyttige til at vælge den bedste eller mest hensigtsmæssige strategi for lægemiddelbehandling og/eller til at lokalisere den primære tumor med henblik på strålebehandling og/eller kirurgi.
Referencer og links
Fælles anvendte antistoffer til kræftdiagnostik:
Gremel G et al., A systematic analysis of commonly used antibodies in cancer diagnostics. Histopathology. (2014)
PubMed: 24330150 DOI: 10.1111/his.12255
En gennemgang om validering af antistoffer til IHC:
O’Hurley G et al., Garbage in, garbage out: a critical evaluation of strategies used for validation of immunohistochemical biomarkers. Mol Oncol. (2014)
PubMed: 24725481 DOI: 10.1016/j.molonc.2014.03.008
Antibodypedia – En database med åben adgang til offentligt tilgængelige antistoffer og deres anvendelighed i forskellige applikationer:
IHC world – Protocols, Forum, Products, and more:
Et YouTube-klip, der illustrerer IHC fra BioGenexLaboratories: