Immunoassay Screening af Diphenhydramin (Benadryl®) i urin og blod Using a Newly Developed Assay

Traditionelle metoder til testning for DPH i plasma hos mennesker har involveret dyr og tidskrævende prøveekstraktion efterfulgt af bekræftelsesprocedurer. Flere grupper har rapporteret om anvendelse af forskellige gaskromatografiske (GC) metoder til påvisning af DPH i plasma og urin (23-27). Der er også blevet rapporteret om kapillarelektroforese (28) og væskekromatografi-massespektrometriske (LC-MS) metoder (29), som er blevet udviklet til påvisning af DPH. Indtil videre har der ikke været nogen rapporter i litteraturen om screening for diphenhydramin ved hjælp af ELISA eller nogen anden immunoassaymetode. I denne publikation rapporterer vi om den første ELISA-screeningsmetode for DPH i human urin og blod.

Det betragtes som standardpraksis i toksikologiske laboratorier at udføre en immunoassay-screening, hvor positive prøver først identificeres og yderligere bekræftes ved GC-MS eller LC-MS teknikker. Dette anvendes af de fleste toksikologiske laboratorier som en “cost-benefit”-strategi i modsætning til at udføre en dyrere bekræftelsesprocedure for hver enkelt prøve, de modtager. Det ville derfor være nyttigt med en pålidelig ELISA-screeningsmetode, der kan anvendes på DPH-prøver i forbindelse med trafikulykker og dødsulykker. For at nå dette mål har toksikologer fremsat anbefalinger for DUID, herunder et foreslået grænseværdien for DPH på 25 ng/mL i blod og 50 ng/mL i urin (30). I denne artikel beskrives en robust og præcis ELISA-screeningsmetode for DPH i human urin og blod, der følger disse foreslåede retningslinjer.

Eksperimentelt

Materialer

Reagenser og kemikalier. Diphenhydramin blev indhentet fra Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), og diphenhydramin-d3 (100 μg/mL opløsning i methanol) blev indhentet fra Cerilliant (Round Rock, TX). DPH-specifikt polyklonalt antistof blev fremstillet af Immunalysis (Pomona, CA), og DPH-haptener og peberrodsperoxidase-mærkede konjugater blev syntetiseret hos Immunalysis. Substratreagenset 3,3′,5,5,5′-tetramethylbenzidin (TMB), der blev anvendt til den kolorimetriske reaktion, blev anskaffet hos Pierce (Rockford, IL). De enzymer, der blev anvendt i processen, var bovin thyroglobulin (BTG) fra Sigma-Aldrich (Milwaukee, WI), peberrodsperoxidase (HRP) fra BBI Enzymes (Madison, WI) og bovin serumalbumin (BSA) fra Proliant Biologicals (Boone, IA). Alle anvendte opløsningsmidler var af HPLC-kvalitet, og alle kemikalier var af ACS-kvalitet og blev fremstillet af Spectrum Chemicals (Gardena, CA). Til ELISA blev de høje kalibratorer for DPH på 1000 ng/mL fremstillet i syntetisk negativ urin og syntetisk negativt blod og opbevaret ved 4 °C. Syntetisk negativ urin og syntetisk negativt blod, der anvendes i dette assay, er blevet formuleret med ingredienser, der findes i de respektive matricer, og matchede immunoassayresponserne fra tre negative humane urin- og blodprøver (31, 32). Syntetisk negativ urin består af en 0,1 % BSA-opløsning i deioniseret vand; med 0,2 % FD&C-gult #6-farvestof, og syntetisk negativt blod består af en proprietær Immunalysis-formulering.

Apparat. HiTrap protein G HP affinitetskolonner, der blev anvendt til oprensning af immunoglobulin G (IgG), blev købt hos GE Healthcare (Pittsburgh, PA). Standardpolystyrenmikrotiterplader (96 brønde) blev købt hos Corning Costar (Corning, NY). En Tecan Columbus Pro mikrotiterpladevaskemaskine og en Tecan Sunrise pladelæser blev begge anskaffet fra Tecan (San Jose, CA). De pipetter, der blev anvendt i forbindelse med udviklingen af immunoassayet, blev alle købt hos Rainin Instruments (Oakland, CA). En 6410 triple-quadrupol MS og Zorbax Eclipse XDB C18-kolonnen, der blev anvendt til LC-MS-MS-analyse, blev begge købt hos Agilent Technologies (Santa Clara, CA).

Metoder

ELISA. Det primære trin i udviklingen af ELISA-metoden omfattede generering af polyklonale antistoffer, der var baseret på den immunokemiske reaktion fra en udvalgt dyreart på et DPH-specifikt antigen. Med henblik på dette mål blev kaniner først immuniseret med et DPH-antigen bestående af DPH konjugeret til bovint thyroglobulin (BTG). Immuniseringsprocessen og afblødning af kaninerne blev udliciteret til et specialiseret dyrecenter. Serumet fra kaninerne blev renset internt ved affinitetskromatografi ved eluering gennem protein G-kolonner med henblik på at opnå den rensede IgG-fraktion. Det DPH-specifikke polyklonale IgG blev derefter immobiliseret på polystyren-mikrotiterplader med 96 brønde. Det overskydende antistof blev opsuget, de frie antistofbindingssteder blev blokeret med en 1 % trehaloseopløsning i vand, og pladerne blev derefter tørret i en vakuumovn ved 37 °C natten over. Pladerne blev yderligere opbevaret i en forseglet pose med tørremiddel, da det er vigtigt at holde dem fugtfri. Der blev først udarbejdet en DPH-urin-dosisresponskurve ved at berige negativ syntetisk urin med 1, 2, 5, 10, 10, 25, 50, 100, 250 og 500 ng/mL fra den høje kalibrator-stamopløsning af lægemidlet. Blodkurven blev fremstillet ved at forstærke negativt syntetisk blod med 1, 5, 10, 25, 50, 100 og 250 ng/mL fra den høje kalibratoropløsning. Disse kalibratorer i syntetisk blod blev derefter yderligere fortyndet 1:10 med 100 mM fosfatbuffer indeholdende 150 mM natriumklorid (fosfatbufferet saltvand, pH 7,0) inden analysen. Alle blodprøver blev på samme måde fortyndet 1:10 med fosfatbufferet saltvand (pH 7,0). Urinprøverne blev også fortyndet 1:20 med 100 mM fosfatbufferet saltvand (pH 7,0). Kalibratorer og prøver blev derefter pipetteret i to eksemplarer i mikrotiterpladens brønde, idet der blev anvendt en prøvestørrelse på 10 μl for både urin og blod. Herefter blev der tilsat 100 μL enzymkonjugat bestående af diphenhydramin mærket med HRP. Pladen blev derefter sat til at inkubere i 1 time i mørke ved stuetemperatur. Brøndene blev derefter vasket seks gange med 350 μL afioniseret vand ved hjælp af en mikrotiterpladevasker, der blev suget for at fjerne vand, hvorefter brøndene blev vendt på hovedet og tørret af for at fjerne eventuelle rester af vand fra brøndene. Det kromogene TMB-substrat (100 μL) blev derefter tilsat til hver brønd, og pladen blev inkuberet i yderligere 30 minutter i mørke. Reaktionen blev derefter stoppet med 100 μL 1 N saltsyre for at frembringe en gul farve. Assayet er kolorimetrisk, og absorbansen blev aflæst ved en dobbelt bølgelængde på 450 nm og 650 nm ved hjælp af en mikrotiterpladelæser. Ved bølgelængden på 650 nm måles baggrundsabsorbansen, som pladelæseren derefter trækker fra den endelige absorbans. Intensiteten af den producerede farve er omvendt proportional med koncentrationen af analysanden i prøven.

LC-MS-MS. Til analysen blev der anvendt en LC-pumpe i 1200-serien koblet til en 6410 triple-quadrupol-MS, der arbejder i positiv elektrospray-ioniseringstilstand (ESI). Den anvendte LC-MS-MS-kolonne var en Zorbax Eclipse XDB C18-kolonne (4,6 × 50 mm × 1,8 µm). Prøven til analyse blev forberedt på følgende måde: en 100 µL urinprøve indeholdende 50 µL diphenhydramin-d3 (200 ng/mL) blev tilsat til et autosampler-flaske. Prøverne blev sprøjtet direkte ind i LC-MS-MS’en via en autoinjektor. Søjletemperaturen blev holdt på 60 °C, og injektionsvolumenet var 5 µL. Den mobile fase bestod af 0,2 % eddikesyre pH 4 (opløsningsmiddel A) og methanol (opløsningsmiddel B). I første omgang var sammensætningen af den mobile fase 100 % A ved en strømningshastighed på 0,7 mL/min over en periode på 6 min, hvorefter procentdelen af methanol blev øget til 100 %, hvorefter den igen vendte tilbage til 100 % A efter 7 min.

Gastemperaturen var 350 °C, gasstrømmen var 10 L/min, og forstøverens tryk blev holdt på 50 psi. Der blev anvendt kvælstof som kollisionsgas, og kapillærspændingen var 4000 V. Der blev udvalgt og optimeret to overgange for hvert lægemiddel. Opholdstiden var 50 ms, og den optimale fragmenteringsenergi var 80 V for alle overgangene. De optimale kollisionsenergispændinger blev bestemt til at være 35V for den deutererede interne standard (diphenhydramin-d3), 15V for den primære overgang og 30V for den sekundære overgang for selve diphenhydramin. Forholdet mellem den kvalificerende overgang og den kvantificerende overgang blev bestemt til omtrent midtpunktet af kalibreringsområdet: 100 ng/mL. Overgangen for diphenhydramin-d3 var 259,7 > 165,2; den primære (kvantificerende) overgang for diphenhydramin var 256,7 > 167,2; den kvalificerende (sekundære) overgang 256,7 > 152,2. Ikke-mærket diphenhydramin kan opdeles i produktioner med m/z 167 eller 165 fra forløberionen, afhængigt af den anvendte kollisionsenergi. Vores procedure blev valideret ved hjælp af de beskrevne betingelser. Detektionsgrænsen (LOD) for LC-MS-MS-metoden var 10 ng/mL og blev bestemt til at være den laveste koncentration, der kan påvises med et signal/støjforhold > 2.

Resultater og diskussion

Dose-respons kurve

Metoden anvender kompetitiv binding mellem enzymkonjugatet og den frie analysand i prøven for en fast mængde af antistofbindingssteder, der er proportional med deres koncentration i blandingen. Dosisresponskurverne for DPH blev fremstillet i syntetisk negativ urin og syntetisk negativt blod ved de tidligere beskrevne koncentrationer. B0 er absorbansen af den negative kalibrator, og B repræsenterer absorbansen af de enkelte kalibratorniveauer. Det procentvise forhold mellem den individuelle kalibrator og den negative kalibrator (B/B0) blev beregnet for hvert kalibratorniveau og plottet op mod lægemiddelkoncentrationen (ng/mL) for både urin og blod (figur 3). B/B0-værdierne er omvendt proportionale med koncentrationen af lægemiddel i prøven, hvilket skyldes, at jo højere lægemiddelkoncentrationen er, jo mindre lægemiddel-enzymkonjugat binder til antistoffet og dermed giver en lavere absorbansværdi.

Sammensætninger, der ikke var relateret til DPH, blev også analyseret ved koncentrationer på 100.000 ng/mL i assayet. Tabel II viser krydsreaktiviteten med disse ikke-relaterede forbindelser. De fleste af disse forbindelser interfererede ikke med påvisningen af DPH i assayet. På grund af ligheder i sidekædestrukturen viste flere forbindelser som amitriptylin, chlorpromazin, clomipramin, doxepin, imipramin og cyclobenzaprin varierende grader af krydsreaktivitet med assayet. Bekræftelsesmetoder ville fortrinsvis udelukke falske positive resultater, der påvises ved ELISA-analysen som følge af disse krydsreaktanter, som kan interferere med DPH-assayet. Matrixeffekter fra DPH-frie autentiske urin- og blodprøver blev også undersøgt for at bestemme deres indvirkning på assayet. Der blev ikke observeret uønskede falsk-positive resultater som følge af urin- og blodmatricer, da LC-MS-MS-bekræftede DPH-frie urin- og blodprøver blev screenet med assayet.