H MODELLER FOR TRANSCRIPTIONEL REGULERING AF β-GLOBIN LOCUS
Genetisk manipulation af β-globin locus og de deraf følgende virkninger på transkription, DNase følsomhed, histon acetylering osv.., har ført til udvikling af to hovedmodeller til at forklare, hvordan dette komplekse locus reguleres (for oversigter, se Bulger og Groudine, 1999; Engel og Tanimoto, 2000; Fraser og Grosveld, 1998; Orkin, 1995). Disse modeller fokuserer på, hvordan LCR og dens flankerende regioner fungerer til at regulere ekspression og locusåbning.
Looping- eller konkurrencemodellen hævder, at Hispanic-deletionselementet (indeholdende LCR) fungerer ved at komme direkte i kontakt med promotoren for det gen inden for β-globin-locus, der skal udtrykkes. Det er blevet vist, at initiering af transkriptet kun sker ved én promotor på et hvilket som helst tidspunkt i en given celle (Gribnau et al., 1998). Denne model forklarer, at initiering af en enkelt promotor er et resultat af promotorernes konkurrence om kontakt med LCR’en. En sådan direkte kontakt ville naturligvis kræve looping af det mellemliggende kromatin, men endnu er der ingen direkte beviser for en sådan looping. Transgener, der indeholder LCR og enten et enkelt humant foster- (γ) eller voksen- (β) globin-gen, udtrykte generne gennem hele udviklingen uden udviklingsspecificitet; transgener, der indeholder LCR og begge gener, genoprettede imidlertid normal udviklingsmæssig ekspression, hvilket indikerer, at genkonkurrence er vigtig for korrekt reguleret ekspression (Behringer et al., 1990; Enver et al., 1990). Analyse af transgener, der indeholder en ekstra kopi af β-globin-genet og promotoren, understøttede lignende konklusioner. Når den ekstra kopi blev placeret tæt på LCR’en (som erstatning for det embryonale ∊-globin-gen), blev den udtrykt 10 til 100 gange mere effektivt end den kopi af β-globin-genet, der befandt sig på sin normale placering langt nedstrøms i transgenet. Transkription af den ekstra kopi blev påvist i et tidligt udviklingsstadium, hvor kun embryonale globingener normalt udtrykkes. Når det ekstra β-globin-gen blev indsat lige opstrøms for den normale kopi, var ekspressionen fra de to kopier nogenlunde ækvivalent. Det er vigtigt at bemærke, at det samlede niveau af transgene β-globin-geners transkription forblev konstant uanset placeringen af den ekstra kopi og var omtrent lig med mængden af transkription afledt af det endogene β-globin-gen (Dillon et al., 1997). Inversion af β-globin-genklyngen i forhold til LCR’en i en transgen konstruktion resulterede i alvorlige forstyrrelser af genekspressionen. β-globin blev udtrykt på alle udviklingsstadier, mens det embryonale gen (∊) slet ikke blev udtrykt overhovedet. Transkriptionen af de to humane γ-globin-gener blev også reduceret, formentlig på grund af konkurrence med de voksne globingener om LCR’en. I vildtypelokusset er transkriptniveauerne for de to γ-globingener forskellige. I den inverterede β-globin-genklynge transgen blev ekspressionsniveauerne for disse to gener omvendt, hvilket tyder på konkurrence (Tanimoto et al., 1999). Disse resultater argumenterer for, at nærhed til LCR’en er en vigtig determinant for gentranskription i β-globin locus.
Den forbindende model foreslår, at direkte kontakt mellem regulatoriske elementer ikke behøver at forekomme. Den regulatoriske Hispanic-deletionsregion og andre ukendte kromatinelementer foreslås at tjene som platforme for udbredelse af åbne kromatinstrukturer i hele locus. Kromatinet ville blive åbnet og fastholdt i denne konfiguration af proteinkomplekser, der strækker sig lineært langs DNA’et. Sådanne komplekser vil derfor forbinde LCR med promotorerne. Forskellige genpromotorer vil derefter tjene til at rekruttere udviklingsmæssige og genspecifikke faktorer til individuel genekspression. Analyser af transgener, der indeholder den humane LCR og individuelle gener som f.eks. det embryonale globin-gen (∊) og de føtale globin-gener (γ), har vist, at korrekt udviklingsmæssig ekspression af disse gener sker i fravær af ethvert andet globin-gen (Dillon og Grosveld, 1991; Lloyd et al., 1992; Shih et al., 1990). Disse data synes at være i modstrid med andre undersøgelser (Behringer et al., 1990; Enver et al., 1990). Formentlig forklarer forskelle i de transgene konstruktioner og dermed i præcis hvilke cis-virkende reguleringselementer, der blev inkluderet, diskrepanserne. Konkurrence kan forklares ved hjælp af linking-modellen, f.eks. ved at påberåbe sig grænselementer, der forhindrer udbredelse af tilgængelighed. Globin-genpromotorerne er blevet foreslået at virke i denne egenskab og forhindre nedstrøms locusåbning (Bulger og Groudine, 1999).
Enten af modellerne eller en kombination af dem kunne forklare den modulation af kromatinstrukturen, der ligger til grund for den cellulære kontrol af antigenreceptor-genomlægningen. Looping-modellen giver en attraktiv mekanisme for et cis-virkende element til at påvirke fjerntliggende elementer uden at kræve, at det forstyrrer kromatinstrukturen af det mellemliggende DNA. F.eks. kunne en direkte interaktion mellem IgH’s introniske forstærker og en VH-promotor selektivt åbne kromatinstrukturen omkring RSS’en i dette V-gen-segment og bringe RSS’en i umiddelbar nærhed af DJ-gen-segmentet. Linking-modellen er en attraktiv måde, hvorpå strukturelle ændringer i kromatin kan udbredes fra et element til at omfatte et helt domæne. F.eks. kunne TCRβ-lokalets tilgængelighed starte ved forstærkeren og bevæge sig opstrøms gennem D-gen-segmenterne til V-gen-segmenterne, hvilket giver mulighed for progressiv RSS-adgang.