00:00:07.25Hej, mit navn er Jennifer Doudna fra UC Berkeley
00:00:09.26og jeg er her i dag for at fortælle jer om, hvordan vi opdagede
00:00:12.26en ny teknologi inden for genomteknik.
00:00:00:15.07Denne historie starter med et bakterielt immunsystem
00:00:20.12som betyder at forstå, hvordan bakterier
00:00:22.14bekæmper en virusinfektion.
00:00:24.26Det viser sig, at en masse bakterier
00:00:28.04har i deres kromosom,
00:00:00:30.09som er det, du ser på her
00:00:32.15en sekvens af gentagelser, der er vist i disse sorte diamanter
00:00:36.18som er adskilt af sekvenser
00:00:00:40.19that stammer fra virus
00:00:00:43.08og disse er blevet bemærket af mikrobiologer
00:00:00:46.20som sekventerede bakterielle genomer, men ingen vidste
00:00:00:50.10hvad funktionen af disse sekvenser kunne være
00:00:00:53.06, indtil det blev bemærket, at de har en tendens til også at forekomme
00:00:58.09 sammen med en række gener, der ofte koder for proteiner
00:01:03.29der har homologi med enzymer, der gør interessante ting
00:01:09.03som DNA-reparation.
00:01:10.12Så det var en hypotese, at dette system
00:01:14.04som kom til at blive kaldt CRISPR
00:01:16.08som er en forkortelse for denne type gentagende locus
00:01:19.14at disse CRISPR-systemer faktisk kunne være
00:01:22.29 et erhvervet immunsystem i bakterier
00:01:26.00som kan gøre det muligt at integrere sekvenser
00:01:29.06fra virus og derefter på en eller anden måde bruge dem senere
00:01:32.07til at beskytte cellen mod en infektion
00:01:35.07.26med den samme virus.
00:01:37.05Så det var en interessant hypotese
00:01:39.11og vi blev involveret i at studere dette
00:01:41.18i midten af 2000’erne lige efter offentliggørelsen
00:01:44.18.15af tre artikler, der påpegede
00:01:47.13indarbejdelsen af virale sekvenser
00:01:50.00i disse genomiske loci.
00:01:52.07Og det, der viste sig i løbet af de næste mange år
00:01:55.17 , var, at disse CRISPR-systemer
00:01:58.17 faktisk var en del af det, der blev anvendt i disse CRISPR-systemer
00:01:58.08 virkelig er erhvervede immunsystemer i bakterier
00:02:01.18så indtil dette tidspunkt vidste ingen, at bakterier
00:02:04.24 faktisk kunne have en måde at tilpasse sig
00:02:08.08til virus, der kommer ind i cellen
00:02:10.08.29men dette er en måde, hvorpå de gør det
00:02:12.14og det involverer detektering af fremmed DNA
00:02:15.17som bliver injiceret som vist i dette eksempel
00:02:18.04fra en virus, der kommer ind i cellen
00:02:20.07, tillader CRISPR-systemet integration
00:02:26.06af korte stykker af disse virale DNA-molekyler
00:02:29.15i CRISPR-lokussen
00:02:31.07og derefter i det andet trin
00:02:33.27som her er vist som CRISPR RNA-biogenese
00:02:38.Disse CRISPR-sekvenser transskriberes faktisk
00:02:42.20i cellen til stykker RNA
00:02:45.15der efterfølgende anvendes sammen
00:02:48.23med proteiner, der er kodet af CAS-generne
00:02:52.09 disse CRISPR-associerede gener
00:02:54.01for at danne interferens- eller interferenskomplekser
00:02:58.12der kan bruge informationen i form
00:03:01.17af disse RNA-molekyler til at baseparre
00:03:04.08med matchende sekvenser i viralt DNA.
00:03:07.18Så en meget smart måde, som bakterier
00:03:10.12har fundet på for at tage deres angribere
00:03:13.06og vende sekvensinformationerne imod dem.
00:03:17.00Så i mit eget laboratorium
00:03:20.21har vi i lang tid
00:03:23.09 været meget interesserede i at forstå, hvordan RNA-molekyler
00:03:26.03bruges til at hjælpe cellerne med at finde ud af
00:03:32.00hvordan de kan regulere ekspressionen af proteiner
00:03:34.00.03fra genomet.
00:03:35.05Og så dette virkede også som et meget interessant
00:03:37.27eksempel på dette, og
00:03:39.18vi begyndte at studere de grundlæggende molekylære mekanismer
00:03:42.24 , hvormed denne vej fungerer.
00:03:45.01Og i 2011 tog jeg til en videnskabelig konference
00:03:49.23og mødte en af mine kolleger,
00:03:52.13Emmanuelle Charpentier, som er vist på dette billede
00:03:56.10på det yderste venstre og Emmanuelles laboratorium
00:03:58.13.14 arbejder med mikrobiologiske problemer, og de er
00:04:02.11specielt interesserede i bakterier
00:04:04.00der er patogener for mennesker.
00:04:06.01Hun studerede en organisme kaldet
00:04:08.03Streptococcus pyogenes, som er en bakterie
00:04:11.15der kan forårsage meget alvorlige infektioner hos mennesker
00:04:14.25og hvad der var mærkeligt ved dette insekt var, at det
00:04:16.25har et CRISPR-system og i denne organisme
00:04:19.25har et CRISPR-system og i denne organisme
00:04:19.06 var der et enkelt gen, der kodede for et protein
00:04:21.27 kendt som Cas9
00:04:23.12der genetisk havde vist sig at være nødvendigt
00:04:26.09for CRISPR-systemets funktion
00:04:28.16i Streptococcus pyogenes,
00:04:30.1623men ingen vidste på det tidspunkt, hvad funktionen
00:04:33.05 af dette protein var.
00:04:34.20Så vi gik sammen og rekrutterede
00:04:37.20folk fra vores respektive forskningslaboratorier
00:04:40.26for at begynde at teste Cas9’s funktion.
00:04:43.17Så de vigtigste personer i projektet
00:04:45.20er vist her på billedet
00:04:48.00i midten er Martin Jinek
00:04:50.03som er postdoc i mit eget laboratorium
00:04:52.17og ved siden af ham i den blå skjorte
00:04:54.22er Kryztof Chylinski, som var studerende
00:04:57.20i Emmanuelles laboratorium
00:04:58.26og så disse to fyre sammen med
00:05:00.21Ines Fonfara, som er yderst til højre,
00:05:02.10en postdoc med Emmanuelle
00:05:04.01begyndte at lave eksperimenter på tværs af Atlanten
00:05:07.25og dele deres data.
00:05:10.09Og det, de fandt ud af, var, at
00:05:13.06Cas9 faktisk er et fascinerende protein
00:05:16.04der har evnen til at interagere med DNA
00:05:19.28og generere et dobbeltstrenget brud
00:05:22.02i DNA ved sekvenser, der matcher
00:05:25.06sekvensen i et guide RNA
00:05:27.06.08og på dette dias kan du se
00:05:05:29.06at guide-RNA
00:05:30.10og sekvensen af guiden i orange
00:05:32.11at baseparrerer med den ene streng
00:05:34.18af det dobbeltspiralformede DNA
00:05:37.18.11og meget vigtigt er, at dette RNA
00:05:39.28 interagerer med et andet RNA-molekyle
00:05:42.09kaldt tracr, der danner en struktur
00:05:46.03som rekrutterer Cas9-proteinet
00:05:47.29 så disse to RNA’er og et enkelt protein
00:05:50.13 i naturen er det, der er nødvendigt
00:05:52.23for at dette protein kan genkende
00:05:56.05hvad der normalt ville være virale DNA’er
00:05:58.11i cellen, og proteinet
00:06:01.13er i stand til at skære disse op,
00:06:02.14 bogstaveligt talt ved at bryde det dobbeltspiralformede DNA op.
00:06:05.24Så da vi fandt ud af dette
00:06:08.14 tænkte vi: ville det ikke være fantastisk
00:06:10.26 hvis vi faktisk kunne generere et enklere system
00:06:13.29som naturen har gjort
00:06:15.02ved at sammenkæde disse to RNA-molekyler
00:06:18.04for at skabe et system, der ville bestå af et enkelt protein
00:06:20.16og et enkelt styrende RNA.
00:06:22.28Så ideen var dybest set at tage
00:06:25.17 disse to RNA’er, som du ser på den anden side
00:06:29.29af diaset, og så dybest set forbinde dem sammen
00:06:33.19for at skabe det, vi kalder
00:06:35.04 et enkelt vejledende RNA.
00:06:36.04.Så Martin Jinek i laboratoriet
00:06:38.25 lavede denne konstruktion
00:06:40.21og vi lavede et meget simpelt eksperiment
00:06:44.22 for at teste, om vi virkelig havde
00:06:46.18 et programmerbart DNA-spaltningsenzym
00:06:49.18.29og ideen var at generere korte enkelte guide RNA’er
00:06:54.04som genkender forskellige steder i et cirkulært DNA-molekyle
00:06:59.24som du ser her
00:07:00.21og guide RNA’erne blev designet
00:07:03.10 til at genkende de sekvenser, der er vist med de røde streger
00:07:06.17på diaset, og eksperimentet var derefter
00:07:10.16at tage dette plasmid, dette cirkulære DNA-molekyle
00:07:13.21og inkubere det med to forskellige restriktions- (eller skære-) enzymer,
00:07:18.21og inkubere det med to forskellige restriktionsenzymer,
00:07:18.27en der hedder SalI, som skærer
00:07:21.23 DNA’et opstrøms i den yderste ende
00:07:25.05af DNA’et i dette billede
00:07:26.12i den grå boks,
00:07:27.19og det andet sted er rettet
00:07:31.19 mod det andet sted, som er rettet
00:07:31.00af den RNA-vejledte Cas9
00:07:33.13på disse forskellige steder vist i rødt.
00:07:35.16Og et meget simpelt eksperiment
00:07:37.19vi lavede denne inkubationsreaktion
00:07:39.19.26med plasmid-DNA, og dette er resultatet
00:07:43.24og det er altså det, du ser på
00:07:45.28som er en agarosegel
00:07:47.29som giver os mulighed for at adskille
00:07:49.16de spaltede DNA-molekyler
00:07:51.16.20og det, man kan se, er, at vi i hver af disse reaktionsbaner
00:07:54.22 får et DNA-molekyle af forskellig størrelse frigivet
00:07:58.12fra dette dobbelt fordøjede plasmid
00:08:00.16 , hvor DNA’ets størrelse
00:08:03.29 svarer til spaltning på de forskellige steder
00:08:06.11dirigeret af disse guide RNA-sekvenser
00:08:08.26indiceret med rødt
00:08:10.24så dette var et virkelig spændende øjeblik
00:08:12.29og det var faktisk et meget simpelt eksperiment, der var
00:08:15.15som en slags “A ha!”-øjeblik
00:08:17.03, da vi sagde, at vi virkelig har et programmerbart DNA-skæreenzym
00:08:22.02og at vi kan programmere det med et kort stykke RNA
00:08:24.15 til at kløve stort set enhver dobbeltstrenget DNA-sekvens
00:08:28.15.07, så grunden til, at vi var så begejstrede
00:08:30.23over et enzym, der kan programmeres
00:08:33.19til at generere dobbeltstrengede DNA-brud
00:08:36.01i en hvilken som helst sekvens, er, fordi
00:08:39.00der var en lang række eksperimenter
00:08:42.16i det videnskabelige samfund, der viste
00:08:45.13at cellerne har måder at reparere dobbeltstrengede DNA-brud
00:08:49.26der fører til ændringer
00:08:52.02i den genomiske information i DNA
00:08:55.21så dette er et dias, der viser, at
00:08:58.20når et dobbeltstrenget brud er genereret
00:09:01.14af en hvilken som helst form for enzym, der kan gøre dette
00:09:04.13herunder Cas9-systemet
00:09:06.05Disse dobbeltstrengede brud i en celle
00:09:09.07opdages og repareres af to typer af veje
00:09:13.15en til venstre, der involverer
00:09:17.26non-homologous end joining
00:09:20.07hvor DNA-enderne kemisk forbindes
00:09:24.07tilbage til hinanden, normalt med introduktion
00:09:26.18af en lille insertion eller deletion
00:09:28.25på brudstedet
00:09:29.25.27og på den højre side
00:09:32.01er en anden måde, hvorpå reparation finder sted
00:09:34.00gennem homologirettet reparation
00:09:37.22hvor et donor-DNA-molekyle
00:09:39.14der har sekvenser, der matcher dem
00:09:43.14.28, der flankerer det sted, hvor den dobbeltstrengede brud er opstået, kan integreres
00:09:48.05 i genomet på det sted, hvor bruddet er opstået, for at indføre ny genetisk information
00:09:54.06 i genomet
00:09:55.06.15så dette havde givet mange forskere
00:09:59.04den idé, at hvis der fandtes et værktøj
00:10:01.04eller en teknologi, der tillod
00:10:03.05forskere eller forskere at indføre
00:10:06.12dobbeltstrengede brud på målrettede steder
00:10:09.04.00i en celles DNA, og sammen
00:10:12.12med alle de genomsekventeringsdata
00:10:14.21der nu er tilgængelige, kender vi nu
00:10:16.10den samlede genetiske sekvens af en celle
00:10:18.10.21og hvis man vidste, hvor der er sket en mutation
00:10:21.20som f.eks. forårsager en sygdom
00:10:23.20kan man faktisk bruge en teknologi som denne
00:10:26.25til at indføre DNA, der kan rette en mutation
00:10:31.25.00eller generere en mutation
00:10:32.23som man måske gerne vil studere i forskningsøjemed
00:10:35.04så styrken ved denne teknologi er
00:10:38.28virkeligt idéen om, at vi nu kan generere
00:10:41.20 disse typer af dobbeltstrengede brud
00:10:43.20.17på steder, som vi som forskere vælger
00:10:46.17 ved at programmere Cas9 og derefter tillade
00:10:48.13cellen at foretage reparationer, der indfører
00:10:51.04genomiske ændringer på stederne for disse brud
00:10:54.15men udfordringen var, hvordan man genererede bruddene
00:10:58.11 i første omgang, og der var derfor blevet udviklet en række
00:11:00.09forskellige strategier
00:11:03.24for at gøre dette i forskellige laboratorier
00:11:05.15de fleste af dem, og jeg vil vise
00:11:08.21to specifikke eksempler her
00:11:10.17den ene kaldes zinkfingernukleaser
00:11:12.25og den anden TAL-effektordomæner
00:11:15.02det er begge programmerbare måder
00:11:18.08at generere dobbeltstrengede brud i DNA
00:11:20.21som vil være baseret på proteinbaseret genkendelse
00:11:23.29af DNA-sekvenser, så det er proteiner
00:11:26.06som er modulære og kan genereres
00:11:29.06.12i forskellige kombinationer af moduler
00:11:31.22for at genkende forskellige DNA-sekvenser
00:11:34.03det fungerer som en teknologi
00:11:37.18men det kræver en masse proteinteknik
00:11:40.24for at gøre det, og hvad der er virkelig spændende
00:11:43.16om dette CRISPR/Cas9-enzym
00:11:46.11er, at det er et RNA-programmeret protein
00:11:49.25så et enkelt protein kan bruges til
00:11:52.09alle steder på DNA, hvor vi
00:11:54.27 gerne vil skabe et brud
00:11:56.27.13 ved simpelthen at ændre sekvensen
00:11:58.16af det guide-RNA, der er forbundet med Cas9
00:12:00.24så i stedet for at stole på proteinbaseret genkendelse
00:12:03.06af DNA, stoler vi på
00:12:06.04RNA-baseret genkendelse af DNA
00:12:08.26som vist nederst, så hvad det betyder
00:12:11.03 er, at det er et system
00:12:12.18, der er enkelt nok til at bruge
00:12:15.15, som alle med en grundlæggende molekylærbiologisk uddannelse
00:12:19.03 kan bruge.05kan drage fordel af dette system
00:12:20.29for at lave genomteknik
00:12:22.20og så dette er et værktøj, som virkelig
00:12:26.06jeg tror, udfylder en vigtig
00:12:29.03og tidligere manglende komponent
00:12:30.24af det, vi kunne kalde biologiens it-værktøjskasse
00:12:33.29som ikke kun omfatter evnen
00:12:36.00til at sekventere DNA og se
00:12:38.06på dets struktur, vi har kendt til
00:12:39.24dobbeltspiralen siden 1950’erne
00:12:42.00.00og i de sidste par årtier
00:12:44.18har det været muligt at bruge enzymer
00:12:46.09som restriktionsenzymer
00:12:47.26og polymerasekædereaktionen
00:12:49.09til at isolere og amplificere bestemte segmenter
00:12:52.09.19af DNA, og nu med Cas9
00:12:55.10har vi en teknologi, der muliggør
00:12:57.15facile genome engineering
00:12:59.13og som er tilgængelig for laboratorier over hele verden
00:13:03.07for eksperimenter, som de måske ønsker at udføre
00:13:05.08og dette er altså en sammenfatning af teknologien
00:13:10.11af 2-komponent systemet
00:13:11.29det er afhængig af RNA-DNA base paring
00:13:14.16for genkendelse
00:13:15.21og meget vigtigt på grund af den måde
00:13:18.24det dette system fungerer, er det
00:13:19.28 faktisk ret ligetil
00:13:21.18at lave noget, der kaldes multiplexing
00:13:24.20som betyder, at vi kan programmere Cas9
00:13:27.00med flere forskellige guide-RNA’er
00:13:28.23i den samme celle til at generere
00:13:30.19flere brud og gøre ting
00:13:32.06som at skære store segmenter af et kromosom ud
00:13:35.01og simpelthen slette dem i ét forsøg.
00:13:38.25Og det har ført til en sand eksplosion
00:13:42.03 inden for biologi og genetik
00:13:45.19 med mange laboratorier rundt om i verden
00:13:48.08som anvender denne teknologi
00:13:49.25 til alle mulige meget interessante
00:13:51.15og kreative anvendelser
00:13:53.13og dette er et dias
00:13:54.24der faktisk er næsten forældet nu
00:13:56.11men bare for at give dig en fornemmelse
00:13:57.14af den måde, hvorpå feltet
00:14:00.07har taget fart
00:14:01.08så vi offentliggjorde vores oprindelige arbejde om Cas9
00:14:04.10i 2012, og indtil da
00:14:07.16 var der meget lidt forskning
00:14:08.18 i CRISPR-biologi nogen steder
00:14:11.12det var et meget lille felt
00:14:12.19og så kan man se, at
00:14:13.27fra 2013 og frem til nu har der været en utrolig eksplosion i publikationer
00:14:17.21 fra laboratorier, der bruger dette som en teknologi til genomteknik
00:14:22.09 fra laboratorier, der bruger dette som en teknologi til genomteknik
00:14:24.16.01så det har virkelig været meget spændende for mig
00:14:26.25som grundvidenskabsmand at se det, der startede
00:14:29.22som et grundforskningsprojekt
00:14:31.12som blev til en teknologi, der viser sig
00:14:34.08at være meget anvendelig for alle slags
00:14:35.28af spændende eksperimenter
00:14:37.07og jeg vil gerne slutte af med at dele
00:14:40.07med jer et par ting
00:14:42.17som foregår ved hjælp af denne teknologi
00:14:44.17så selvfølgelig på venstre side
00:14:47.17.13masser af grundlæggende biologi, der kan udføres nu
00:14:50.02med udvikling af modelorganismer
00:14:53.03og forskellige former for cellelinjer
00:14:55.02som dyrkes i laboratoriet
00:14:56.21for at studere cellers adfærd
00:14:58.21.13men også inden for bioteknologi, hvor man kan
00:15:01.23 foretage målrettede ændringer i planter
00:15:05.15og forskellige former for svampe, som kan være meget
00:15:07.11nyttige til forskellige former for industrielle anvendelser
00:15:09.29og så naturligvis inden for biomedicin
00:15:12.14med stor interesse for potentialet
00:15:14.14.14at bruge denne teknologi som et værktøj
00:15:17.03for virkelig at finde frem til nye behandlinger
00:15:21.06for menneskelige sygdomme, tror jeg er noget
00:15:23.09som er meget spændende og virkelig er noget
00:15:26.05som allerede er på vej i horisonten
00:15:27.09og dette dias viser virkelig
00:15:30.20hvor jeg tror, at vi vil se det hen ad vejen
00:15:33.15 i fremtiden med en masse interessante
00:15:36.20og kreative retninger
00:15:39.03der er på vej i forskellige laboratorier
00:15:41.02både i akademiske forskningslaboratorier
00:15:43.19men også i stigende grad i kommercielle laboratorier
00:15:45.29som vil gøre det muligt at anvende denne teknologi til alle mulige anvendelser
00:15:49.24og mange af dem kunne vi ikke engang have
00:15:54.10 forestillet os for bare to år siden.
00:15:56.05Så meget spændende, og jeg vil gerne takke et fantastisk team
00:16:01.10af mennesker, der har været involveret i at arbejde
00:16:04.22på projektet sammen med mig, og vi har
00:16:06.07havde også fantastisk økonomisk støtte fra forskellige grupper
00:16:11.00og det har været en fornøjelse
00:16:13.00at dele dette med jer, tak.