Metodologiske fremgangsmåder
Genetik af CAVD’er har historisk set været forbundet med CF siden 1968, da Kaplan et al. viste, at næsten alle mænd med CF har obstruktiv azoospermi (OA) på grund af CBAVD (Kaplan et al. 1968). Idéen om, at isolerede former for CBAVD og cystisk fibrose er knyttet til det samme gen, blev bekræftet kort efter, at CFTR-genet blev identificeret i 1989 (Dumur et al. 1990; Anguiano et al. 1992). Det blev imidlertid hurtigt konstateret, at 20-40 % af CBAVD-tilfældene ikke var knyttet til CFTR-mutationer, hvilket tyder på muligheden af genetisk heterogenitet (Culard et al. 1994; Chillón et al. 1995). Ikke desto mindre forblev genetikken af CAVD i 25 år begrænset til CFTR. Faktum er, at undersøgelsen af den genetiske determinisme af menneskelig infertilitet længe har været begrænset af specifikke metodologiske begrænsninger, idet de traditionelle familiebaserede tilgange ved hjælp af linkageanalyse ofte er uanvendelige, især i forbindelse med mandlig infertilitet på grund af psykosociale og kulturelle barrierer. Derfor var de genetiske markører, der indtil for nylig almindeligvis blev anvendt i klinisk praksis til at undersøge en ikke-obstruktiv azoospermi (NOA), begrænset til kromosomale abnormiteter såsom Klinefelters syndrom og Y-kromosom-mikrodeletioner (Krausz 2011). I løbet af det sidste årti har fremkomsten af næste generations sekventering (NGS) imidlertid gjort det muligt at udvikle kraftfulde tilgange baseret på whole-exome-sekventering (WES) eller whole-genome-sekventering (WGS) og whole-transkriptomanalyse. Ca. 20 gener, der er involveret i monogene former af NOA, er for nylig blevet identificeret (gennemgået af Ghieh et al. 2019). For næsten alle disse gener er kausale mutationer, alle recessive, blevet identificeret i consanguine familier (Yang et al. 2018). På den anden side er der, så vidt vi ved, aldrig blevet observeret ekstraordinære familietilfælde af OA i en kontekst af consanguinitet, en begrænsning, der delvis forklarer, hvorfor antallet af nye gener identificeret i CAVD har været langt lavere på trods af faciliteterne i de nye genomiske tilgange. Ikke desto mindre har to vigtige komplementære tilgange i de seneste år bidraget til identifikationen af kandidatgener; dem, der er baseret på undersøgelse af individuelle genomer, og dem, der er baseret på analyse af transkriptomer fra sædkanalceller, hovedsageligt fra epididymis. Den første førte til etablering af relevante korrelationer mellem iCBAVD og punktmutationer i ADGRG2-genet identificeret ved WES-analyse (Patat et al. 2016; Khan et al. 2018) samt copy-number-variationer af PANK2- og SLC9A3-generne identificeret ved array-baseret komparativ genomisk hybridisering (array-CGH) analyse (Lee et al. 2009). Transkriptomiske tilgange ved hjælp af cDNA-mikroarray eller RNA-sekventering har haft held til at målrette mange funktionelle kandidatgener, især gener, hvis ekspression er begrænset til celler i sædkanalen eller hvis ekspressionsprofil er specifik for visse dele af sædkanalen (Browne et al. 2016). Flere af disse kandidatgener såsom ADGRG2 og SLC9A3 er blevet valideret i knockout-mus, og deres fysiologi er blevet undersøgt i denne dyremodel (Davies et al. 2004; Wang et al. 2017). For nylig har en integrativ multi-omisk tilgang, der kombinerer WGS, hel DNA-methylomanalyse og RNA-sekventering, ført til identifikation af to nye kandidatgener, SCNNN1B og CA12, i et individ med iCBAVD (Shen et al. 2019). På trods af disse fremskridt findes der dog stadig ingen genetisk diagnose for mindst en fjerdedel af CAVD’erne, hvoraf de fleste er CUAVD’er. Indtil nu er hypotesen om, at disse uforklarlige former for CAVD ikke er resultatet af simple genetiske variationer, kun i ringe grad blevet udforsket. Det kan forudses, at de nye metoder til undersøgelse af epigenomet og de bioinformatiske værktøjers styrke i fremtiden vil gøre det muligt at specificere den rolle, som epigenomisk regulering spiller for forekomsten af disse isolerede CAVD’er. Denne tilgang vil dog være så meget desto mere vellykket, hvis den anvendes på kohorter af tilstrækkelig størrelse bestående af perfekt fænotypede CAVD-patienter af homogen etnisk oprindelse.
Gener, der er involveret i CAVD
Mens den genetiske determinisme af NOA’er er kendetegnet ved en betydelig genetisk heterogenitet med mere end 30 identificerede gener (SPGF ), er den af OA’er begrænset til meget få gener (Ghieh et al. 2019). Derfor er det fastslået, at ca. tre fjerdedele af de kaukasiske tilfælde af CAVD er knyttet til anomalier i to gener: CFTR for størstedelen af tilfældene og ADGRG2 for et mindretal (Patat et al. 2016). Andre gener såsom SLC9A3 kan være involveret i nogle iCBAVD’er, men også epigenetiske eller miljømæssige faktorer med meget forskellige fysiopatologiske roller.
CFTR (MIM#602421) blev identificeret ved positionskloning i 1989 af Riordan et al. (1989), der afsluttede flere års konkurrerende forskning for at finde det eneste gen, der var ansvarlig for CF. Ca. halvdelen af CF-patienter af nordeuropæisk afstamning er homozygote for en deletion på tre basepar (NM_000493.3:c.1521_1523del), hvilket resulterer i tab af phenylalanin 508 (NP_000483.3:p.Phe508del, arvenavn: F508del). I gennemsnit er 1 ud af 40 individer i den kaukasiske befolkning heterozygot for p.Phe508del-mutationen, hvilket gør den til en af de hyppigst forekommende patogene mutationer hos mennesker (Kerem et al. 1989). CFTR, som dækker 250 kb på den lange arm af kromosom 7 i 7q31.2, indeholder 27 kodende exoner og producerer flere transkript, hvoraf kun ét, et mRNA på 6,1 kb, koder for et funktionelt protein på 1 480 aminosyrer kaldet CF transmembrane conductance regulator (CFTR). CFTR er et glykosyleret transmembranprotein, der udtrykkes ved den apikale membran i mange epitelceller, hvor det hovedsagelig fungerer som en cAMP-reguleret kloridkanal. Mange undersøgelser har vist, at CFTR er involveret i reguleringen af flere iontransportører, herunder natriumkanaler (ENacs), klorid/bicarbonat-udvekslere, protonsudvekslere (Na+/H+) og vandkanaler (aquaporiner). CFTR-afhængige fysiologiske processer spiller derfor en afgørende rolle i opretholdelsen af homeostase af ioner, pH og vand i sekretoriske epithelvæsker (Choi et al. 2001). I løbet af 3 årtier er der rapporteret mere end 2000 mutationer i CFTR (https://www.genet.sickkids.on.ca/), men mindre end en fjerdedel er klassificeret som patogener (https://www.cftr2.org/) på grundlag af korrelationer med CF eller andre tilstande, der ofte har en mindre alvorlig prognose, begrænset til et enkelt organ som f.eks. bronkierne (dissemineret bronkiektasi, MIM#211400), bugspytkirtlen (kronisk pancreatitis MIM#167800) eller sædlederne (medfødt bilateral fravær af sædlederne, MIM#277180). Disse tilstande, der ikke opfylder alle kriterierne for cystisk fibrose, men som er relateret til CFTR-dysfunktion, er blevet grupperet under den generiske betegnelse CFTR-RD (Bombieri et al. 2011). Alle regioner af CFTR kan påvirkes af sygdomsforårsagende mutationer, herunder promotorregioner og dybe introniske regioner (Feng et al. 2019; Bergougnoux et al. 2019). Afhængigt af deres virkninger på CFTR’s biogenese og funktioner er patogene alleler klassificeret i to hovedkategorier: CF-fremkaldende varianter (også kaldet “alvorlige”), som i homozygot tilstand altid er forbundet med CF, og ikke-CF-fremkaldende varianter, som aldrig er blevet observeret hos CF-patienter, og som derfor fejlagtigt kaldes “milde” alleler. Et mindretal af CF-fremkaldende alleler er blevet observeret i varierende kliniske former for mere eller mindre alvorlig cystisk fibrose, hvor bugspytkirtelfunktionen ofte er bevaret. Patogeniciteten af disse alleler, der kaldes VCC (for varianter af varierende klinisk konsekvens), kan afhænge af sjældent kendte genetiske faktorer som f.eks. cis-association med komplekse alleler eller ukendte ikke-genetiske faktorer. I modsætning til CF-forårsagende varianter forårsager ikke-CF-forårsagende varianter en ufuldstændig CFTR-dysfunktion. Afhængigt af organet kan der opstå en CFTR-RD, hvis den resterende aktivitet af CFTR er for lav til at opretholde homøostase. Derfor er personer med CFTR-RD generelt bærere af en ikke-CF-fremkaldende variant, som oftest kombineret i trans med en CF-fremkaldende variant eller, mere sjældent, med en anden ikke-CF-fremkaldende variant. Disse alleler omtales undertiden som CFTR-RD-forårsagende alleler.
ADGRG2 (MIM#300372), der er placeret i Xp22.13, består af 29 exoner, der producerer ca. ti transkripter, hvoraf det længste har en åben læseramme på 3,1 kb (dækker exon 3-29), der koder for den adhæsive G-protein-koblede receptor G2 (ADGRG2). Dens cDNA blev oprindeligt klonet i 1997 af Osterhoff et al. (1997) efter differentiel screening af et bibliotek af humane epididymale cDNA-celler, hvor denne klon, kaldet HE6 (for human epididymis-specific protein 6), var stærkt repræsenteret. Med en afledt sekvens på 1017 aminosyrer og sine syv meget velbevarede transmembrandomæner tilhører HE6-proteinet superfamilien af G-protein-koblede receptorer (GPCR), hvor det oprindeligt blev omtalt som GPR64. Strukturen og den autokatalytiske egenskab af den ekstracellulære del af HE6/GPCR64 førte til dens endelige klassificering i G-underfamilien af adhæsions-GPCR (aGPCR) (Hamann et al. 2015). ADGRG2 er et stærkt glykosyleret protein næsten udelukkende og stærkt udtrykt i den proximale del af mandlige sædkanaler (https://proteinatlas.org), netop i epitelet af de efferente duktler og den indledende del af den epididymale kanal. ADGRG2-immunmærkningen er særlig stærk i stereocilia af de vigtigste epididymale celler og i mikrovilli af de ikke-cilierede celler i de efferente duktler, hvor 90 % af den væske, der udskilles af testiklerne, reabsorberes (Kirchhoff et al. 2008; Patat et al. 2016). ADGRG2’s involvering i denne proces blev oprindeligt antydet af HE6/GPR64 knockout (målrettet disruption) hos mus, hvilket hos hemizygote hanner resulterer i en ophobning af væske i testiklerne og sædstase i de efferente duktler, hvilket fører til en obstruktiv infertilitetsfænotype (Davies et al. 2004). ADGRG2 er en forældreløs receptor med ukendte naturlige ligander og delvist opklarede signalveje. Som de fleste aGPCR’er er moden ADGRG2 en heterodimer, der er et resultat af spaltning på et meget velbevaret domæne, der indeholder GPCR-proteolysestedet (GPS) i et ekstracellulært N-terminalt fragment (NTF), der er ikke-kovalent knyttet til et stort C-terminalt fragment (CTF), der er forankret i cellemembranen (Obermann et al. 2003). Hvordan disse to underenheder samarbejder under påvirkning af endogene agonister for at formidle signaler, og om de har separate specifikke funktioner, er spørgsmål, der fortsat er ubesvarede. Det er imidlertid blevet vist, at den ekstracellulære ende af CTF’en, der er resultatet af spaltning, bærer en Stachel-sekvens med agonistiske egenskaber (Demberg et al. 2015). Desuden viser nylige eksperimentelle data opnået i in vitro- og in vivo-modeller, at ADGRG2 via Gs- og Gq-proteinmedieret signalering er i stand til at modulere henholdsvis c-AMP- og PKC-aktivitet (Demberg et al. 2017; Balenga et al. 2016; Zhang et al. 2018).
Causale mutationer i CAVD, type og epidemiologi
CFTR-mutationer
Mindre end et år efter, at CFTR-genet blev identificeret (Riordan et al. 1989), observerede Dumur et al. en unormalt høj frekvens af p.Phe508del-mutation i en lille serie infertile mænd med iCBAVD (Dumur et al. 1990). Denne opdagelse, som støttede hypotesen om, at iCBAVD kunne være en monosymptomatisk form for cystisk fibrose, havde en stor medicinsk konsekvens. Herefter skulle alle mænd med iCBAVD, der blev underkastet medicinsk assisteret reproduktionsteknologi (ART) ved kirurgisk udtagning af sædceller og intracytoplasmisk sædinjektion (ICSI), anses for at have en højere risiko for at få et barn med cystisk fibrose (Anguiano et al. 1992). Senere bekræftede Chillon et al. at i modsætning til CF-patienter, der kun bærer CF-fremkaldende mutationer, der er ansvarlige for et fuldstændigt tab af CFTR-kloridkanalfunktionen, bærer iCBAVD-patienter mindst én CFTR-kopi med en såkaldt “mild” mutation, fordi den korrelerer med en reduceret eller delvis CFTR-aktivitet på 3-8 % (Chillón et al. 1995). Denne situation illustreres godt af en variant af en polythymidin (Tn)-polymorfi i intron 9 (NM_000493.3:c.1210-12T), den såkaldte IVS8-5T-allel (5T-allel), hvis frekvens er fire til fem gange højere hos iCBAVD-personerne (gennemgået af De Sousa et al. 2018). Denne 5T-allel har en skadelig effekt på splejsning, som fremmer overspringen af exon 10, hvilket fører til en betydelig reduktion i normalt CFTR mRNA (Chu et al. 1993). Op til en tredjedel af iCBAVD-personerne af europæisk afstamning er sammensatte heterozygoter, der bærer en CF-fremkaldende mutation, hvoraf den hyppigste er F508del, og 5 T-allelen i trans (Chillón et al. 1995). Da denne genotype imidlertid var blevet observeret hos fertile fædre, der havde et barn med CF, viste Cuppens et al. imidlertid, at penetrancen af denne 5 T-allel med hensyn til exon 10-skipping hovedsageligt var afhængig af størrelsen af en polyTG-polymorf sekvens (NM_000493.3:c.1210-34TG) opstrøms for polyT-sekvensen (Cuppens et al. 1998). Mens den polyvariante TG(11)5T (NM_000493.3:c.1210-34TGT) således findes overvejende hos raske personer, er det TG(12)5T-kombinationen, der oftest findes hos iCBAVD-personer, mens den langt sjældnere TG(13)5T-allel altid identificeres hos iCBAVD-personer (Groman et al. 2004). I løbet af de sidste 20 år har talrige undersøgelser gjort det muligt at karakterisere CFTR-mutationsspektret hos CBAVD-personer ved at specificere deres frekvens i henhold til etnicitet og geografisk oprindelse (gennemgået af Yu et al. 2012). Mens de samme typer af alvorlige mutationer, herunder store CFTR-rearrangementer (Taulan et al. 2007), findes hos både CF-CBAVD- og iCBAVD-personerne, er CFTR-mutationsspektret i iCBAVD radikalt anderledes, idet der findes mange ikke-CF-fremkaldende mutationer, hvoraf de fleste kan være forbundet med andre CFTR-RD-fænotyper såsom pancreatopatier, dissemineret bronkiektase og sinonasale lidelser (Bombieri et al. 2011). Disse “milde” mutationer omfatter hovedsagelig introniske varianter, der påvirker splejsning, hvoraf den hyppigste er 5T-allelen, og talrige missense-mutationer, der påvirker kloridkanalens funktion, hvoraf den hyppigste hos kaukasiere er p.Arg117His (R117H)-mutationen (Casals et al. 2000; Claustres et al. 2000). De fleste af disse ikke-CF-fremkaldende mutationer påvises ikke af rutinepaneler, der er udviklet til den klassiske CF-population, og som hovedsagelig er rettet mod de hyppigst forekommende CF-fremkaldende mutationer (mange tilgængelige kommercielle kits). Derfor anbefales det med henblik på molekylær diagnose af CBAVD’er og andre CFTR-RD’er at vælge en CFTR-test, der omfatter de to vigtigste “milde” varianter, R117H, og 5T-allelen, som førstevalgstest (se nedenfor i kapitlet “Implikationer for klinisk praksis …”). Hvis dette ikke giver noget resultat, bør der foretages en omfattende karakterisering af CFTR, herunder som minimum sekventering af alle exoner og flankerende introniske regioner samt en søgning efter store rearrangementer. Molekylærdiagnostiske metoder baseret på sekventering af nye generationer (NGS) anvendes i stigende grad til påvisning ikke kun af punktmutationer, men også af store deletioner eller duplikationer. Disse nye genscanningsmetoder, der kan anvendes på et panel, gør det muligt at undgå de besværlige Sanger-sekventeringsteknikker og semi-kvantitative PCR-teknikker (MLPA, QMPSF, qPCR osv.), der udføres exon for exon.
Frekvenserne af CFTR-mutationer hos CAVD-patienter varierer fra undersøgelse til undersøgelse, hvilket sandsynligvis skyldes en rekrutteringsbias, kohortens størrelse og heterogeniteten i genotypebestemmelsesmetoderne, idet mange forsøgspersoner har fået foretaget en delvis analyse af CFTR. Det er dog klart, at hyppigheden af nogle alleler er meget forskellig hos kaukasiske CAVD-patienter og hos patienter fra ikke kaukasiske lande, hvor cystisk fibrose er langt mere sjældent forekommende. Dette er især tilfældet med F508del-mutationen, som kun undtagelsesvis påvises hos kinesiske iCBAVD-patienter, mens op til en tredjedel af iCBAVD-patienterne i Nordeuropa er bærere. På den anden side er iCBAVD-patienter af asiatisk oprindelse oftere bærere af 5T-allelen end kaukasiere (tabel 1), mens hyppigheden af denne allel i den generelle befolkning varierer lidt rundt om i verden (5 %). Samlet set viser metaanalysen af de data, der er offentliggjort af Yu et al (2012), at ca. 80 % af de kaukasiske iCBAVD-patienter er bærere af mindst én mutation i CFTR. Den mest udtømmende undersøgelse, der er mulig, efterlader 6 % af forsøgspersonerne uden nogen påvist mutation (Ratbi et al. 2007). I betragtning af at nogle af disse patienter kan være simple heterozygoter (3 % i den kaukasiske befolkning) og andre bærer varianter af ukendt betydning, som muligvis er neutrale (ikke CF- eller CFTR-RD-fremkaldende), kan det antages, at CFTR vil være involveret i 75-80 % af tilfældene af iCBAVD. For ca. en fjerdedel af iCBAVD-patienterne kan CFTR-ansvaret derfor ikke endeligt påvises, mens de to muterede alleler for CF-patienter kan karakteriseres i 99 % af tilfældene (tabel 1). For CUAVD’er bærer 30-50 % af personerne mindst én CFTR-mutation efter omfattende genscanning, hvilket betyder, at mere end halvdelen af CUAVD’erne ikke er CFTR-relaterede (Schlegel et al. 1996; Casals et al. 2000; Cai et al. 2019; Mieusset et al. 2020). Tilstedeværelsen af en renal abnormitet er meget signifikant hyppigere hos CAVD-patienter, hos hvem der kun er påvist én eller ingen CFTR-afvigelse (Augarten et al. 1994; Schwarzer & Schwarz 2012). Det kan derfor antages, at forskellen i andelen af ikke-detekterede CFTR-mutationer mellem CBAVD (20 %) og CUAVD (50 %) i det mindste delvist hænger sammen med forskellen i hyppigheden af unilateral nyreagenese, der er observeret i de to grupper, henholdsvis 5 % vs. 25 % (Weiske et al. 2000; McCallum et al. 2001; Kolettis og Sandlow 2002; Yang et al. 2015).
ADGRG2-mutationer
I 2016, efter omhyggeligt at have udvalgt, fra en stor retrospektiv serie af 379 iCBAVD-mænd af europæisk afstamning, en kohorte af 26 personer, der hverken havde CFTR-mutation eller associeret nyreafvigelse, valgte Patat et al. identificerede tre hæmizygote truncating mutationer i det X-bundne ADGRG2-gen (MIM#300572.0001_3) hos fire personer (Patat et al. 2016). Etableringen af den kausale rolle af disse mutationer i iCBAVD-fænototypen var baseret på en række argumenter: (i) hanlige ADGRG2 knockout (KO) mus udvikler OA uden nogen anden væsentlig abnormitet (Davies et al. 2004), (ii) histologisk undersøgelse af en epidididymal biopsi af en af de fire individer viste en mangel på ekspression af ADGRG2 i epitelet af efferente duktler, der var unormalt udvidede, (iii) en af de trunkerede mutationer blev identificeret hos to infertile individer relateret via en moderlig forbindelse (en nevø og en onkel af moderen). Siden da har tre publikationer (Yang et al. 2017; Yuan et al. 2019; Khan et al. 2018) rapporteret om identifikation af fem nye sjældne variationer af ADGRG2 hos seks iCBAVD-patienter af asiatisk oprindelse uden patogene CFTR-mutationer: to nonsense-mutationer klassificeret som patogene, herunder en hos to infertile brødre af pakistansk oprindelse (Khan et al. 2018) og tre missense-mutationer, herunder en, der påvirker GPS-regionen, som blev klassificeret som patogen (Yang et al. 2017). Disse seks patienter havde ingen nyreafvigelser. For nylig har Pagin et al. også rapporteret seks nye ADGRG2 truncating mutationer i en kohorte af 53 franske CAVD-patienter, der bærer 0 eller kun 1 CFTR-defekt allel. I denne undersøgelse lykkedes det ikke forfatterne at opnå overbevisende beviser til støtte for hypotesen om en digenisk arv, der involverer ADGRG2 og CFTR. De konkluderede, at inaktivering af ADGRG2 er ansvarlig for ca. 20 % af CAVD, der ikke er relateret til CFTR-dysfunktion. Desuden fandt de ikke noget tilfælde af solitær nyre blandt de 8 ADGRG2-muterede patienter i deres kohorte (Pagin et al. 2019). Interessant nok blev ingen ADGRG2- eller CFTR-mutationer identificeret af Patat et al. i en kohorte af 28 iCBAVD-patienter med URA (personlige data).
Andre mutationer
Så vidt vi ved, er de eneste andre mutationer ud over CFTR og ADGRG2, der har rejst spørgsmålet om en mulig sammenhæng med iCBAVD, CNV’er, der involverer PANK2- og SLC9A3-generne. Indtil nu er disse CNV’er kun blevet beskrevet hos iCBAVD-patienter fra Taiwan. Som i andre asiatiske befolkninger observeres CF og CFTR-RD sjældent i Taiwan, og bortset fra IVS8-5T-allelen, hvis frekvens er signifikant øget hos infertile taiwanesiske iCBAVD-mænd, er meget få patogene CFTR-alleler blevet karakteriseret (Chiang et al. 2009). Ved at undersøge CNV’er ved hjælp af array-CGH og kvantitativ realtids-PCR i en lille kohorte af taiwanesiske iCBAVD-individer identificerede HS Chiangs team hos et enkelt individ det homozygote tab af pantothenatkinase 2-genet (PANK2) (Lee et al. 2009) og hos 11 ud af 29 personer tab af en kopi af genet for solute carrier family 9 isoform 3 (SLC9A3) (Wu et al. 2018; gennemgået af Chiang et al. 2019). PANK2 blev udvalgt som et potentielt reproduktionsrelateret gen, fordi KO-musen havde azoospermi (Kuo et al. 2005). Det var imidlertid en NOA, og denne tilstand er ikke observeret hos berørte mennesker med pantothenatkinase-associeret neurodegeneration (MIM#234200). Til dato er der ikke blevet rapporteret om andre tilfælde af CBAVD relateret til en deletion af PANK2. Derfor er sammenhængen fortsat usikker og observationen anekdotisk. På den anden side er de eksperimentelle data, der er opnået af det samme hold om SLC9A3’s inddragelse i CBAVD-fænototypen, væsentlige og mere overbevisende. Faktisk viste disse forfattere, at den voksne hanmus SLC9A3-/- udvikler obstruktiv azoospermi på grund af strukturelle og funktionelle abnormiteter i de efferente duktler med langsigtet progressiv atrofi af vas deferens og sædblærerne (Wu et al. 2019; Chiang et al. 2019). Bemærkelsesværdigt observerede forfatterne et drastisk fald i CFTR i epididymis og vas deferens i disse SLC9A3-KO-mus, hvilket tyder på interdependente roller af de to gener i iCBAVD-determinisme (Wang et al. 2017). På trods af disse meget oplysende observationer om SLC9A3’s rolle i fysiologien i reproduktionskanalen hos hanmus, er forholdet mellem tabet af en kopi af dette gen og iCBAVD hos mennesker imidlertid stadig dårligt forstået. I betragtning af at de recessive mutationer af SLC9A3 forårsager en alvorlig form for medfødt diarré ved natriumsekretion (congenital secretory sodium diarrhea, MIM#616868), og at loss-of-function-mutationer, herunder en fuldstændig deletion af SLC9A3, er blevet vist at blive overført af heterozygote fædre (Janecke et al. 2015), kan CBAVD hos taiwanesiske patienter ikke forklares alene ved SLC9A3 haploinsufficiens. Desuden har Wu et al. i sin undersøgelse rapporteret, at blandt de 29 taiwanesiske patienter med iCBAVD blev 6 (20,7 %) fundet homozygote eller sammensatte heterozygote for CFTR TG(12)5T- eller TG(13)5T-allelerne, en genotypisk status, der i sig selv kunne være tilstrækkelig til at forårsage iCBAVD. Af disse seks personer havde to af dem kun én kopi af SLC9A3. Fra samme kohorte var 12 andre iCBAVD-patienter heterozygote for TG(12)5T- eller TG(13)5T-allelen, hvoraf halvdelen af dem også havde en deletion af SLC9A3 (Wu et al. 2019). Muligheden af digenisme, der involverer CFTR-variationer som f.eks. 5T-allelen, er stadig meget spekulativ. Det skal bemærkes, at ingen af disse 29 taiwanesiske CBAVD-patienter havde unilateralt nyrefravær.