dNTP står for deoxyribose nucleotidtrifosfat og anvendes i PCR til at udvide den voksende DNA-streng. dATP, dTTP, dGTP og dTTP er fire almindelige dNTP’er, der anvendes i PCR.
Den funktion, dNTP’er har i PCR, er at udvide den voksende DNA-streng ved hjælp af Taq DNA-polymerase. Den binder sig til den komplementære DNA-streng ved hjælp af hydrogenbindinger. PCR er en in vitro-teknik til DNA-syntese. Formålet med at udføre PCR er at generere flere kopier af DNA-fragmenter af vores interesse for at visualisere det under gelelektroforese.
Målet med PCR er at fremstille millioner af DNA-kopier til forskellige downstream-applikationer som DNA-sekventering eller DNA-mikroarray.
Polymerasekædereaktionen er det uovertrufne værktøj, der har været anvendt i molekylærgenetisk forskning siden dens opdagelse. DNA-skabelon, primere, buffer, Taq DNA-polymerase og dNTP’er er ingredienserne i PCR. For at forstå mekanismen i PCR skal vi lære betydningen af hver enkelt ingrediens, der anvendes i den,
I denne artikel diskuterer vi en af de vigtigste ingredienser i PCR, nemlig dNTP’erne. Vi vil også se på dens struktur, og hvorfor den er så vigtig.
Vi vil desuden også tale om mekanismen for samspillet mellem dNTP’er og Taq DNA-polymerase og deres arbejde på den voksende DNA-streng.
Vi vil desuden tale om mekanismen for, hvordan dNTP’er og DNA-polymerase interagerer og hjælper med at vokse DNA-strengen.
Læs videre om PCR-relaterede artikler,
- DMSO’s rolle i PCR: DMSO en PCR-forstærker
- Funktion af taq DNA-polymerase i PCR
- Retningslinjer for design af primere til PCR
- Rolle af MgCl2 i PCR-reaktionen
Nøgleemner:
Hvad er dNTP’er?
DNTP’erne er de kunstige nukleotider, der bruges i PCR til at syntetisere nye DNA-strenge på samme måde som DNA-replikation. dATP, dTTP, dGTP, dTTP er almindelige nukleotider, der findes i PCR-mastermixet.
Struktur af dNTP’er:
dNTP står for deoxyribose-nukleotidtriphosphat.
Først skal vi forstå flere grundlæggende terminologier såsom base, nukleotider, nukleosider, ribonukleotider, deoxyribonukleotider, deoxyribonukleotider, dideoxy ribonukleotider for at forstå dNTP’er. Disse er nogle grundlæggende termer, der rutinemæssigt anvendes i genetik, men alligevel misforstår folk dem.
Adenin og Guanin er purinbaser, mens cytosin og thymin er pyrimidinbaser. Nitrogenbaserede baser kan ikke danne DNA direkte. Phosphatrygge og pentosesukker er desuden nødvendige for at danne et DNA-molekyle.
Nukleotidet består af et pentosesukker, fosfat og en nitrogenbas. Et nukleotid binder sig til et andet tilstødende nukleotid med en fosfodiesterbinding, mens et nukleotid binder sig til et andet nukleotid på den modsatte DNA-streng med hydrogenbindinger.
Billedet viser strukturen af deoxyribose-trifosfat, difosfat og monofosfat.
Læs mere om DNA’s struktur: DNA-historie: Når fosfatet ikke er forbundet med nukleotidet (eller mangler), kaldes det et nukleosid (nukleotid uden fosfat betegnes som et nukleosid).
Når et hydrogenatom erstatter hydroxylgruppen i pentosesukker, kaldes sukkeret et deoxysukker. DNA består af deoxypentosesukker, mens RNA består af det eneste ribosesukker.
DdNTP’erne er kæden af nukleotider, der består af ribose, nitrogenbase og fosfat.
Dertil kommer, at ddNTP’er er forskellige fra dNTP’er.
Dideoxynukleotidtriphosphat har ikke en fri 3’OH-gruppe, en anden 3′ OH-gruppe af sukker er erstattet af hydrogen.
Dermed kan det ikke forårsage udvidelse af en voksende DNA-streng. Så disse typer ddATP, ddTTP, ddCTP og ddGTP anvendes ved DNA-sekventering. Vi vil diskutere ddNTP’ernes rolle i sekventering udførligt i en anden artikel.
DddNTP’erne bruges i kædeafbrydelsesmetoden til at stoppe udvidelsen af DNA-syntesen.
Billedet viser forskellen mellem ribosesukker, deoxyribosesukker og deoxyribosesukker.
Trifosfatet består af tre forskellige fosfatmolekyler, som danner en rygrad til DNA’et.
DNA’s fosfatryggekæde består af tre forskellige fosfatmolekyler kaldet alfa-, beta- og gammafosfat. Når ét fosfat eller gammafosfat frigøres, kaldes strukturen for deoxynukleotiddiphosphat.
Sådan er det også, når to ud af de tre fosfater frigøres, at strukturen kaldes for deoxynukleotidmonofosfat.
dATP og dGTP er puriner, mens dCTP og dTTP er pyrimidin-dNTP’er, der anvendes i PCR-reaktionen. Funktionen af dNTP’er i PCR er den samme som ved in vivo replikation. Hvis du er interesseret i at læse forskellene mellem nukleotider vs. nukleosider og puriner vs. pyrimidiner, kan du læse disse artikler:
- Puriner vs. pyrimidiner
- Nucleotider vs. nukleosider
Billedet repræsenterer fire forskellige dNTP’ers struktur.
dNTP’ernes funktion:
DNTP’erne er ingredienserne i PCR, RT-PCR, DNA-sekventering eller DNA-mikroarray, der hjælper med at dyrke DNA’et eller forstærkning af DNA.
Virkningsmekanisme:
Processen ved PCR er opdelt i tre temperaturafhængige trin:
- Denaturering
- Annealing
- Extension.
I denatureringstrinnet denatureres det dobbeltstrengede DNA til enkeltstrenget DNA; i annealingstrinnet binder primeren på det nøjagtige sted, hvor dens komplementære sekvens er til stede, og
i extensionstrinnet tilføjer Taq DNA-polymerasen dNTP’erne til den voksende DNA-streng.
Når strengen er åbnet, og primeren binder med enkeltstrenget DNA, starter Taq DNA-polymerasen sin katalytiske aktivitet.
Taq DNA-polymerasen bruger det enkeltstrengede DNA som substrat for den enzymatiske aktivitet og sætter sig på primer-DNA-forbindelsen.
Den ene ende af Taq DNA-polymerasen binder sig i nærheden af 3’OH-gruppen på oligonukleotidprimeren, dette kompleks kaldes P-DNA-komplekset.
Billedet repræsenterer DNA’s struktur med hydrogenbindinger og DNA’s fosfodiesterbinding.
I det næste trin startede dNTP-tilsætningen.
DNTP’en binder med P-DNA-komplekset med svag affinitet, hvis det nøjagtige komplementære nukleotid er til stede. Kort efter holder Taq-DNA-polymerasen fast i den, og hydrogenbindingsinteraktionen mellem en komplementær base og dNTP opstår.
Her er det i begyndelsen ikke hele nukleotidet, men den base (nitrogenbasen), der er til stede på dNTP’en, der bestemmer, om den skal binde eller ej.
Først, hvis den finder den komplementære base på skabelonen ssDNA (A for T og G for C), vil den danne hydrogenbindinger mellem dem. Der fremstilles tre hydrogenbindinger mellem C og G og to hydrogenbindinger mellem A og T.
Når hydrogenbindingen dannes, tilpasser Taq DNA-polymerasen denne binding af dNTP til den voksende DNA-streng ved at danne en fosfodiesterbinding. Efter dannelsen af fosfodiesterbindingen bevæger Taq DNA-polymerasen sig nu et skridt fremad for at tilføje nye dNTP’er.
Fosfodiesterbindingen dannes mellem 3′ OH i primeren og 5′ P i dNTP’en.
Efter dannelsen af hydrogenbindingen katalyserer Taq DNA-polymerasen reaktionen ved at fjerne gamma- og beta-phosphat fra dNTP’s triphosphat. To pyrofosfater (PPi) frigives efter afslutningen af reaktionen.
Den nøjagtige kinetik for, hvordan dNTP’erne og Taq-polymerasen interagerer under PCR-reaktionen, er stadig ikke kendt.
Læs mere om en agarosegelelektroforese,
- Agarosegelelektroforese
- DNA gel loading dye
- EtBr’s rolle i agarosegelelektroforese
Koncentrationen af dNTP’er i PCR:
Generelt er 200μM af hver dNTP’er tilstrækkeligt til en PCR-reaktion med 30 til 35 cyklusser af en kørsel.
200μM hver, hvilket betyder, at der anvendes i alt 800μM af 4 dNTPs-blandinger i en enkelt PCR-reaktion. Vi skal forberede vores arbejdskoncentration ud fra stamopløsningen på 100mM.
I de seneste dage er færdige mastermix imidlertid meget populære og effektive. Den færdige mastermix indeholder alle vigtige ingredienser som f.eks. dNTPs-mix, gel loading dye og Taq DNA-polymerase.
Som naturvidenskabsstuderende er vi nødt til at læne os op ad, hvordan man forbereder arbejdsopløsningen fra lageret. Lad os antage, at vi skal forberede 2 mM arbejdsopløsning fra 100 mM lager.
Nu,
Huskede du V1C1= V2C2?
Her er den givne koncentration C1 100mM (som er lagerkoncentrationen af dNTP’er)
V1 er det givne volumen er ukendt (?)
C2 er den krævede koncentration = 2mM
V2 er det krævede volumen = 1000μL
Nu er V1C1= V2C2
V1= V2C2/ C1
V1= 1000 * 2/ 100
V1= 20μL
Her, 20μL af hver dNTP’er er nødvendige til fremstilling af arbejdsopløsningen, så det endelige volumen for vores blanding er 80μL af (dATP, dCTP, dGTP og dTTPTP) i 920μL D/W.
Dette vil give en endelig koncentration på 2 mM af hver dNTP i 1000μL arbejdsopløsning. Beregn selv til 200μM.
Min ultimative vejledning til brug af dNTP’er i PCR
Overvej altid to rør med stamopløsning, og opbevar alle rørene ved -20°C.
Beregn, hvor mange reaktioner du udfører på en uge, og forbered i overensstemmelse hermed arbejdsopløsningen fra stamopløsningen, og opbevar den ved 4 °C. Fordi gentagen nedfrysning og optøning vil nedsætte dNTP’ernes aktivitet.
Bær altid lyseskuffer og oprethold sterile forhold, mens du forbereder arbejdsopløsningen, fordi kontaminering af fremmed DNA vil hindre i PCR-reaktionen.
Den 200μM koncentration er tilstrækkelig til PCR-reaktion, men til PCR med lang rækkevidde kan der dog anvendes 2 mM til 3 mM koncentration af hver dNTP.
Da koncentrationen af dNTP’er stiger, vil hastigheden af uspecifik binding stige. På samme måde fører knaphed på dNTP’er til ufuldstændige PCR-produkter. Der skal derfor altid anvendes en passende mængde dNTP’er.
Konklusion:
Den endelige konklusion er, at funktionen af dNTP’er i PCR-reaktionen er lige så vigtig som Taq DNA-polymerase.
Med hjælp fra Taq binder dNTP’erne sig til den voksende DNA-streng og udvider den. Hvis du ikke ønsker at rode med alle disse ting, kan du bruge færdige PCR-kits, som er mere at foretrække. Alligevel skal du lære den manuelle metode til fremstilling af reagenser.