Frugtvæske og fostermembran-stamceller: Marker Discovery

Abstract

Fermevæske (AF) og fostermembran (AM) er for nylig blevet karakteriseret som lovende kilder til stamceller eller progenitorceller. Begge indeholder ikke kun subpopulationer med stamcelleegenskaber, der ligner voksne stamceller, såsom mesenkymale stamceller, men udviser også nogle embryonale stamcelleegenskaber såsom (i) ekspression af pluripotensmarkører, (ii) høj ekspansion in vitro eller (iii) flerlagsdifferentieringsevne. Der har for nylig været fokuseret på isolering og detaljeret karakterisering af disse stamcelletyper. Variationer i deres fænotype, deres heterogenitet, der er beskrevet af forskellige grupper, og manglen på en enkelt markør, der kun udtrykkes i disse celler, kan imidlertid forhindre isolering af en ren homogen stamcellepopulation fra disse kilder og deres potentielle anvendelse af disse celler til terapeutiske formål. I denne artikel har vi til formål at opsummere de seneste fremskridt med hensyn til opdagelse af markører for stamceller fra føtale kilder såsom AF og AM ved hjælp af nye metodologier baseret på transkriptomik, proteomik eller sekretomanalyser.

1. Introduktion

Både fostervand (AF) og fostermembran (AM) udgør rige kilder til stamceller, som i fremtiden kan anvendes til kliniske terapeutiske anvendelser. De etiske betænkeligheder ved isolering af stamceller fra disse kilder er minimale , i modsætning til de problemer, der opstår i forbindelse med forskning i menneskelige embryonale stamceller (ESC) . AF indsamles i forbindelse med planlagte fostervandsprøver mellem den 15. og 19. svangerskabsuge med henblik på prænatal diagnose, og den overskydende prøve kan anvendes til celleudvinding , mens AM normalt indsamles i forbindelse med kejsersnit i forbindelse med termograviditeter . På grund af heterogeniteten af stamcellepopulationerne fra disse kilder er det vanskeligt at isolere specifikke celletyper, og det kræver en detaljeret fænotypisk og molekylær karakterisering af de respektive celler. Undersøgelser, der omfatter omics-tilgange, er grundlæggende for bedre at forstå mekanismerne for molekylær ekspression af disse celler og definere de korrekte metoder til deres isolering, før de anvendes i terapeutiske tilgange.

Denne artikel har til formål at præsentere de vigtigste biologiske og molekylære karakteristika ved AF- og AM-afledte stamceller og også at fremhæve de seneste fremskridt inden for opdagelse af markører ved hjælp af globale metoder, såsom transkriptomics, proteomics eller sekretomanalyser.

1.1. Fostervæske

AF tjener som en beskyttende væske for det udviklende embryo og giver mekanisk støtte og de nødvendige næringsstoffer under embryogenesen . Amniocentese har i mange årtier været anvendt i mange årtier som en rutineprocedure til fosterkaryotypebestemmelse og prænatal diagnose, hvilket gør det muligt at påvise en række genetiske sygdomme.

Hovedkomponenten i fostervand er vand; dens samlede sammensætning varierer dog gennem hele graviditeten. I begyndelsen af graviditeten svarer den amniotiske osmolaritet til fosterplasmaet. Efter keratinisering af fosterhuden falder amniotisk osmolaritet relativt til moderens eller fosterets plasma, hovedsagelig på grund af indstrømningen af fosterurin . Mere interessant er det, at AF også udgør en rig kilde til en stamcellepopulation, der stammer fra enten fosteret eller den omgivende fosterhinde . Flere grupper har for nylig foretaget yderligere undersøgelser af de cellulære egenskaber ved celler fra fosterhinden og deres potentielle anvendelse i prækliniske modeller og i transplantationsterapier .

1.1.1.1. Fostervandsstamceller (AFSC’er)

Den amniotiske væskeceller (AFC’er) repræsenterer en heterogen population, der stammer fra de tre kimlag. Disse celler deler en epithelial oprindelse og stammer enten fra det udviklende embryo eller den indre overflade af fostermembranen, som karakteriseres som fostermembranstamceller . AFC’erne består hovedsagelig af tre grupper af adhærente celler, der er kategoriseret på grundlag af deres morfologiske, vækstmæssige og biokemiske egenskaber . Epithelioide (E-type) celler er kuboidale til kolumnatiske celler, der stammer fra fosterhud og urin, fostervandsceller (AF-type) stammer fra fostermembraner, og fibroblastiske (F-type) celler genereres hovedsagelig fra fibrøst bindevæv. Både AF- og F-type celler deler en fibroblastoid morfologi, og den dominerende celletype synes at være AF-typen, der samudtrykker keratiner og vimentiner . Adskillige undersøgelser har dokumenteret, at humane fostervandsstamceller (AFSC’er) let kan udvindes fra en lille mængde AF fra andet trimester, der indsamles under rutinemæssige fostervandsprøver , en procedure med en spontan abortrate på mellem 0,06 og 0,5 % . Hidtil er der blevet rapporteret om en række forskellige dyrkningsprotokoller, der har ført til berigede stamcellepopulationer. Isolering af AFSC og de respektive dyrkningsprotokoller blev sammenfattet i en nylig gennemgang af Klemmt et al. og kan kategoriseres som følger: (i) en enkelttrins dyrkningsprotokol, hvor primærkulturen blev efterladt uforstyrret i 7 dage eller mere, indtil de første kolonier fremkommer , (ii) en totrins dyrkningsprotokol, hvor amniocytter, der ikke var knyttet efter 5 dage i kultur, blev indsamlet og yderligere ekspanderet , (iii) udvælgelse af celleoverflademarkører for CD117 (c-kit-receptor) , (iv) mekanisk isolering af de første mesenkymale progenitorcellekolonier dannet i de oprindelige kulturer , og (v) korttidskulturer til isolering af fibroblastoide kolonier . Størstedelen af de AFSC’er, der blev isoleret efter disse metoder, delte en multipotent mesenkymal fænotype og udviste et højere proliferationspotentiale og et bredere differentieringspotentiale sammenlignet med voksne MSC’er .

1.2. Fostermembran (AM)

Den amniotiske membran, der mangler vaskulært væv, udgør det meste af det indre lag af fostermembranen og er sammensat af 3 lag: (i) et epithelialmonolag bestående af epithelceller, (ii) et acellulært intermediært basallag og (iii) et ydre mesenkymalt cellelag, der er rigt på mesenkymale stamceller og er placeret tæt på chorion . AM har været anvendt i klinikken i mange årtier til sårheling ved forbrændinger, fremme af epiteldannelse og beskyttelse mod infektioner . For nylig er brugen af AM blevet evalueret som et sårforbindingsmateriale til kirurgiske defekter i mundslimhinden , genopbygning af øjenoverfladen , hornhindeperforeringer og forstørrelse af blæren .

1.2.1. Fostermembranstamceller (AMSC’er)

Fostermembranstamceller (AMSC’er) omfatter to typer, de amniotiske epitelceller (AEC’er) og de amniotiske mesenkymale membranstamceller (AM-MSC’er), der stammer fra henholdsvis det amniotiske epitel- og det amniotiske mesenkymale lag . Begge celletyper opstår i fosterudviklingens prægastruktionsstadier, inden de tre primære kimlag afgrænses, og de er for det meste af epithelial art . Der er blevet udarbejdet en række forskellige protokoller til isolering af AEC’er og AM-MSC’er, der primært er baseret på mekanisk adskillelse af AM fra chorionmembranen og efterfølgende enzymatisk fordøjelse . AM-MSC’er udviste plastisk adhærens og fibroblastoid morfologi, mens AEC’er udviste en brosten-epithel-fænotype. AM-MSC’er delte lignende fænotypiske egenskaber med dem, der stammer fra voksne kilder. Mere interessant er det, at AM-MSC’er i lighed med AF-MSC’er udviste en højere proliferationshastighed sammenlignet med MSC’er, der stammer fra voksne kilder, og et multilinje-differentieringspotentiale til celler, der stammer fra de tre kimlag.

2. Immunofænotype

2.1. Fostervandsstamceller

Fostervandsstamceller er for nylig dukket op som en alternativ føtal kilde til en række celler af stamcelleoprindelse . Heri har vi til formål at opsummere de vigtigste markører, der karakteriserer AFSC’er. Til dato repræsenterer MSC’er den bedst karakteriserede subpopulation af AFSC’er . AF-MSC’erne udviste typisk mesenkymal markørudtryk, såsom CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58 og CD44, bestemt ved flowcytometrianalyser . Desuden udtrykte disse celler HLA-ABC-antigenerne, mens ekspressionen af de hæmatopoietiske markører CD34 og CD45, endothelmarkøren CD31 og HLA-DR-antigenet ikke blev påvist . Endnu vigtigere er det, at størstedelen af de dyrkede AF-MSC’er udtrykte pluripotensmarkører såsom octamer binding protein 3/4 (Oct-3/4), homebox transkriptionsfaktoren Nanog (Nanog) og det stadiespecifikke embryonale antigen 4 (SSEA-4) .

Det blev også rapporteret, at amniocytekulturer indeholder en lille population af CD117 (en tyrosinkinase specifik for stamcellefaktor, der primært findes i ESC’er og primordiale kønsceller) positive celler, som kan ekspandere klonalt i kultur . CD117+ AFS’ernes differentieringsegenskaber blev for første gang testet in vivo, hvilket beviser deres stamcelleidentitet . Eksperimentelle beviser tyder på, at AFSC’er stammer fra spindelformede fibroblastoide celler .

I et forsøg på at analysere AFSC-subpopulationerne har vores gruppe for nylig identificeret to morfologisk adskilte populationer af AFSC’er af mesenkymal oprindelse med forskellige proliferations- og differentieringsegenskaber, der betegnes som spindelformede (SS) og rundformede (RS) . Begge subpopulationer udtrykte mesenkymale stamcellemarkører på samme niveau. Det blev dog konstateret, at SS-kolonier udtrykte højere niveauer af CD90- og CD44-antigener end RS-kolonier.

2.2. Amniotiske membranstamceller (AMSC’er)

En detaljeret immunofænotypeanalyse af AMSC’er afslørede ekspression af antigener, såsom CD13, CD29, CD44, CD49e, CD54, CD73, CD90, CD105, , CD166, , stromal stamcellemarkør 1 (Stro-1), SSEA-3, SSEA-4, kollagen I og III (Col1/Col3), alfa-smooth muscle actin (α-SMA), CD44, vimentin (Vim), fibroblast surface protein (FSP) og HLA-ABC-antigen . Intercellulært adhæsionsmolekyle 1 (ICAM-1) blev imidlertid udtrykt i meget lave niveauer, og proteinerne TRA-1-60, vaskulært celleadhæsionsprotein 1 (VCAM-1), von Willebrand-faktor (vWF), platelet endothelial cell adhesionsmolekyle (PECAM-1), CD3 og HLA-DR blev ikke påvist . Et af de mest hyppigt forekommende proteiner, der findes i AM-afledte celler, er laminin, som spiller en central rolle i differentiering, celleform og migration samt vævsregeneration . RT-PCR-analyser viste endvidere, at AMSC’er udtrykte gener såsom Oct-3/4, zinkfingerprotein 42 (zfp42 eller Rex-1), stamcellefaktorprotein (SCF), neuralcelleadhæsionsmolekyle (NCAM), nestin (NES), knoglemorfogenetisk protein 4 (BMP-4), GATA-bindingsprotein 4 (GATA-4) og hepatocytkernefaktor 4α (HNF-4α) selv i høje passager . Brachyury, fibroblastvækstfaktor 5 (FGF5), parret bokseprotein (Pax-6) og knoglemorfogenetisk protein 2 (BMP2) transskriptioner blev ikke påvist . Ligeledes var AEC’er positive for CD10, CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, og negative for CD14, CD34, CD45, CD49d og HLA-DR-ekspressioner, som bestemt ved FACS-analyser . Yderligere undersøgelser viste, at AEC’er udtrykte stamcellemarkører såsom SSEA-1, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, kønsbestemmende region Y-box 2 (Sox2), Tra1-60 og Tra1-80, fibroblastvækstfaktor 4 (FGF4), Rex-1, kryptisk protein (CFC-1) og promininin 1 (PROM-1) .

3. Transkriptomik

3.1. Amniotic Fluid Stem Cells

En funktionel analyse af genekspressionssignaturen for AF-MSC’er sammenlignet med bone-marrow- (BM-), cord-blood- (CB-) og AM-MSC’er blev oprindeligt udført af Tsai et al. . Gener udtrykt i MSC’er fra alle tre kilder kunne kategoriseres i grupper relateret til (i) ekstracellulær matrixremodellering (CD44, kollagen II (COL2), insulinlignende vækstfaktor 2 (IGF2), og vævsinhibitor af metalloproteinase 1 (TIMP1)), (ii) cytoskeletregulering (urokinase-type plasminogenaktivator (PLAU) og receptor (PLAUR)), (iii) kemokinregulering og adhæsion (alfa actininin 1 (ACTN1), actin-relateret proteinkompleks underenhed 1B (ARPC1B) og thrombospondin 1 (THBS1)), iv) plasminaktivering (tissue factor pathway inhibitor 2 (TFPI2)), (v) transforming growth factor β (TGFβ)-receptorsignalering (caveolin 1 (Cav1), caveolin 2 (Cav2), cyclinafhængig kinaseinhibitor 1A (CDKN1A)) og vi) gener, der koder for E3 ubiquitinligaser (SMURF) . De opregulerede gener i AF-MSC’er sammenlignet med BM-, CB- og AM-MSC’er omfattede molekyler, der er involveret i uterin modning og sammentrækning, såsom oxytocinreceptor (OXTR) og regulering af prostaglandinsyntese, såsom fosfolipase A2 (PLA2G10). Andre opregulerede gener i denne gruppe var involveret i signaltransduktion relateret til (i) trombinudløst respons ((F2R og F2RL)), (ii) hedgehog-signalering ((hedgehog acyltransferase (HHAT)) og (iii) G-protein-relaterede veje (rho-relateret GTP-bindende protein (RHOF), regulator af G-protein-signalering 5 og 7 (RGS5, RGS7) og fosfolipase C beta 4 (PLCB4)) .

I nylige undersøgelser af AFSC’er beskrev Kim et al. for første gang genekspressionsændringer i den samlede AFSC-population i løbet af forskellige passager ved hjælp af illumina-mikroarray-analyse. 1970 differentielt udtrykte gener blev påvist og kategoriseret i henhold til deres ekspressionsprofiler i 9 forskellige klynger . Gener med gradvist stigende ekspressionsniveauer omfattede kemokin (C-X-C-motiv) ligand 12 (CXCL12), cadherin 6 (CDH6) og folatreceptor 3 (FOLR3). Nedregulerede gener var bl.a. cyklin D2 (CCND2), keratin 8 (K8), IGF2, natriuretisk peptidprækursor (BNP) B og cellulært retinoinsyrebindende protein 2 (CRABPII) . For at få yderligere oplysninger blev der foretaget en chipdataanalyse af aldringsgener, som afslørede en opregulering af gentranskriptioner, såsom nervevækstfaktor beta (NGFβ), insulinreceptorsubstrat 2 (IRS-2), insulinlignende vækstfaktorbindingsprotein 3 (IGFBP-3) og apolipoprotein E (APOE). Udtryk af gener som f.eks. PLAU, E2F-transskriptionsfaktor 1 (E2F1), IGF2, BRCA1-genet (BRCA1), DNA-topoisomerase 2-alpha (TOP2A), PCNA-antigen (PCNA), forkhead box M1 (FOXM1), cyclin-A2-genet (CCNA2), budding uninhibited by benzimidazoles 1 homolog beta (BUB1B) og cyclinafhængig kinase 1 (CDC2), blev gradvist nedreguleret under dyrkningen .

Wolfrum et al. udførte en global genekspressionsanalyse af AFSC’er sammenlignet med iPSC’er afledt af AF (AFiPSC) og ESC’er . Blandt disse gener relateret til selvfornyelse og pluripotens (1299 gener, f.eks. POU class 5 homeobox 1 (POU5F1), Sox2, Nanog, microRNA-bindingsprotein LIN28) og AFSC-specificitet (665 gener, f.eks, OXTR, HHAT, RGS5, neurofibromatose type 2 (NF2), protectin (CD59), tumor necrosis factor superfamily member 10 (TNFSF10), 5′-nucleotidase (NT5E))) blev påvist i AFSC’er . Desuden undersøgte forfatterne ekspressionen af senescens- og telomer-associerede gener i AFSC’er af tidlig og senere passage for at undersøge effekten af reprogrammering på omgåelse af senescens observeret i AFSC-kulturer. Fireogtres gener blev identificeret som differentielt udtrykt i AFSC’er sammenlignet med AFiPSC-linjer. Heraf var telomer-associerede gener og gener, der er involveret i regulering af cellecyklus, såsom mitotic arrest deficient-like 2 (MAD2L2), poly ADP-ribose polymerase 1 (PARP1), replikationsprotein A3 (RPA3), dyskeratosis congenita 1 (DKC1), mutS homolog 6 (MSH6), CHK1 checkpoint homolog (CHEK1), polo-like kinase 1 (PLK1), POU class 2 homeobox 1 (POU2F1), CDC2, Bloom syndrom-genet RecQ helicase-like (BLM), Werner syndrom RecQ helicase-like (WRN), DNA methyltransferase 1 (DNMT1), DNA methyltransferase 3 beta (DNMT3B), lamin B1 (LMNB1) og DNA replikationsfaktor 1 (CDT1) blev nedreguleret i AFSC’er sammenlignet med AFiPSC’er og ESC’er. I modsætning hertil blev peptidylprolyl cis/trans isomerase (PIN1), lamin A/C (LMNA), growth arrest and DNA damage inducible alpha (GADD45A), chromobox homolog 6 (CBX6), NADPH oxidase 4 (NOX4), endoglin (ENG), histon H2B type 2-E (HIST2H2BE), CDKN1A, CDKN2A, vækstdifferentieringsfaktor 15 (GDF15) og serinproteaseinhibitor 1 (SERPINE1), blandt andre, blev opreguleret i AFSC’er sammenlignet med AFiPSC’er og ESC’er .

3.2. Amniotic Membrane Stem Cells

Transcriptomisk analyse ved hjælp af DNA-mikroarrays er blevet rapporteret for AM-MSC’er . Disse eksperimentelle data gav oplysninger om AM-MSC-genekspressionsmønsteret sammenlignet med genekspressionsprofiler for AF-, CB- og BM-MSC’er. Der blev identificeret flere opregulerede gener i AM-MSC’er, der er involveret i regulering af immuntilpasning mellem den maternoplacentale grænseflade. Blandt andet blev spondin 2 (SPON2), interferon alfa-inducerbart protein 27 (IFI27), bradykinininreceptor B1 (BDKRB1), lille inducerbart cytokin underfamilie B-medlem 5 og 6 (SCYB5, SCYB6) og Yamaguchi sarcoma viral-relateret onkogen homolog (LYN) fundet at være opreguleret . Desuden omfattede andre gener med øget ekspression i AM-MSC’er sammenlignet med AF, CB og BM-MSC’er (i) transkriptionsfaktorer, såsom forkhead box F1 (FOXF1), heart and neural crest derivatives expressed 2 (HAND2) og transkriptionsfaktor 21 (TCF21) og (ii) metaboliske enzymer, såsom dipeptidyl-peptidase 6 (DPP6), tryptophan 2,3-dioxygenase (TDO2) og sialyltransferaser (ST’er) .

4. Proteomik

4.1. Fostervandsstamceller

Proteomiske undersøgelser af den samlede AFSC-population, herunder epithelioide (E-type), fostervandsspecifikke (AF-type) og fibroblastiske (F-type) celler, afslørede 2400 pletter, der resulterede i identifikation af 432 forskellige genprodukter. Størstedelen af proteinerne var lokaliseret i cytoplasmaet (33 %), mitokondrier (16 %) og kernen (15 %) og repræsenterede hovedsagelig enzymer (174 proteiner) og strukturelle proteiner (75 proteiner). Der var også en relativt høj procentdel af membran- og membran-associerede proteiner (7%) . Blandt de påviste proteiner svarede 9 til epitelceller, såsom ATP-syntase D-kæde (ATP5H), NADH-ubiquinon-oxidoreduktase 30 kDa-underenhed (NUIM), annexin II (Anx2), annexin IV (Anx4), 40S ribosomalt protein SA (Rpsa), glutathion S-transferase P (GSTP), major vault protein og cytokeratinerne 19 og 7 (CK-19, CK-7), mens 12 proteiner blev rapporteret udtrykt i fibroblaster, herunder fibronectiner, tropomyosiner, transgelin (TAGLN), arp2/3-kompleks 34 kDa-underenhed (P34-arp), gelsolin (Gsn), elongationsfaktor 1-β (EF-1β) og andre. Otte proteiner blev fundet udtrykt i keratinocytter, herunder keratiner, ribonukleoproteiner, Anx2, aetyl-CoA acetyl-transferase (ACAT1) og andre, tre blev udtrykt i epidermis, herunder tropomyosiner og keratiner, og et i mesenkymalcelletypen (vimentin 1 (Vim 1)) .

Reneste undersøgelser gav beviser for, at en mangfoldighed af metaboliske enzymudtryk i amnioncellerne er involveret i metaboliske og genetiske syndromer, og således kan deres påvisning være vigtig for prænatal diagnose. En mere detaljeret analyse til bestemmelse af specifikke metaboliske enzymer, der er til stede i AFSC’er, blev rapporteret af Oh et al. . Der var blevet identificeret 99 proteiner, såsom enzymer til håndtering af kulhydrater, enzymer til håndtering af aminosyrer, proteiner til purinmetabolisme og enzymer til intermediærmetabolisme .

Der blev også udført en proteomisk analyse af forskellige kulturpassager af CD117+ AFSC’er, som viste variationer i proteinekspression, der hovedsageligt opstod i de tidlige passager . Treogtyve proteiner blev udtrykt forskelligt mellem tidlige og sene passager med de mest fastsiddende nedregulerede proteiner, Col1, Col2, vinculin (Vcl), CRABP II, stathmin (STMN1) og cofilin-1 (CFL1). I modsætning hertil øges TAGLN og Col3 i løbet af gennemløbene . Proteiner, der viste dysregulerede niveauer langs passagerne, var 26S protease regulatorisk underenhed 7 (PSMD7), ubiquitin carboxyl terminal hydrolase isoenzym L1 (UCH-L1), det heterogene nukleare ribonukleære protein H (hnRNP H) og TAR DNA-bindingsprotein 43 (TDP-43) .

I 2007 blev det proteomiske kort over humane AF-MSC’er konstrueret og direkte sammenlignet med det kort, der stammer fra BM-MSC’er . 261 forskellige proteiner blev identificeret i AF-MSC’er med størstedelen af proteinerne lokaliseret i cytoplasmaet (41 %), mens andre blev fundet i det endoplasmatiske retikulum (8 %), kernen (13 %), mitokondrier (12 %), ribosomer (1 %), cytoskelet (6 %), cytoplasmaet og kernen (5 %) og sekreterede (2 %) proteiner . AF-MSC’er udtrykte en række proteiner relateret til proliferation og cellevedligeholdelse, såsom ubiquilin-1 (UBQLN1), som er kendt for at kontrollere cellecyklusprogression og cellevækst, det proliferationsassocierede protein 2G4 (PA2G4), et nukleolært vækstregulerende protein, det sekretede protein acidic and rich in cysteine (SPARC), som reguleres under embryogenese og er involveret i styringen af cellecyklus og celleadhæsion, og enhancer of rudimentary homolog (ERH), som også regulerer cellecyklus . TAGLN og galectin 1 (Gal 1), som begge findes i stamceller og er relateret til differentiering, blev også udtrykt i rigelige mængder i AF-MSC’er. Andre proteiner, der blev udtrykt i høje niveauer i AF-MSC’er, var relateret til (i) udvikling, såsom Deltex-3-lignende (DTX3L), og (ii) cytoskeletallets organisation og bevægelse, såsom CFL1, det coactosinlignende protein (CLP) og det aktiverede proteinhomolog (Enah). Som forventet blev Vim også udtrykt i store mængder i AF-MSC’er. I denne undersøgelse blev der også beskrevet en detaljeret sammenligning af de fælles identificerede proteiner i AF-celler og AF-MSC’er .

I vores senere undersøgelse , etablerede vi det proteomiske kort over de to morfologisk forskellige AF mesenkymale progenitorcelletyper (SS og RS) ved hjælp af 2-DE. Femogtyve proteiner blev udtrykt forskelligt i de to subpopulationer. Proteiner, der blev opreguleret i SS-AF-MSC’er sammenlignet med RS-AF-MSC’er, omfattede reticulocalbin-3-prækursor (RCN3), kollagen α1 (I) (COL1α1), FK506-bindende protein 9-prækursor (FKBP9), Rho GDP-dissociation inhibitor 1 (RhoGDI), chlorid intracellulær kanalprotein 4 (CLIC4), tryptophanyl-tRNA-syntetase (TrpRS) og 70 kD heat shock protein (HSP70). Peroxiredoxin 2 (Prdx2), 60 kD heat shock protein (HSP60), GSTP og Anx4 blev opreguleret i RS-AFMPC’er. Proteiner, der kun blev identificeret i RS-AF-MSC’er, omfattede imidlertid kun cytokeratin-8, -18 og -19 (CK-8, -18 og CK-19), cathepsin B (CTSB), CLP og integrin αV-protein (CD51). Mesenkymal-relaterede proteiner, såsom Vim, Gal, Gsn og prohibitin (PHB), blev udtrykt på samme niveau i begge populationer .

4.2. Amniotic Membrane Stem Cells

En detaljeret fremgangsmåde til undersøgelse af humane AM-proteiner blev beskrevet af Hopkinson et al. . I denne undersøgelse foretog forfatterne en proteomisk analyse af AM-prøver, der var forberedt til human transplantation, ved hjælp af 2-DE-geler. Vaskemedierne fra AM-prøverne blev også undersøgt, og de sekreterede proteiner blev identificeret. Proteiner, der blev påvist i både AM og vaskemedierne, tydede på, at der var sket en delvis frigivelse af proteiner. Disse proteiner var for det meste opløselige cytoplasmaproteiner og blev kategoriseret i henhold til deres subcellulære lokalisering og funktion . Et eksempel på de mest hyppige og konsistente proteiner i AM er THBS1, som er rapporteret til at spille en rolle i sårreparation, inflammatorisk respons og angiogenese . Mimecan (også kaldet osteoglycin/OGN) er et andet protein, der er påvist i AM, og som repræsenterer et lille leucinrigt proteoglykan, der findes i bindevævets ECM. Mimecan er rapporteret til at opretholde vævets trækstyrke og hydrering . Desuden blev den større form af mimecan udtrykt i AM-celler og var modtagelig for proteolytisk spaltning . TGF-β-induceret protein ig-h3 (βIG-H3), et ECM-adhæsivt molekyle, der fungerer som en membranassocieret vækstfaktor under celledifferentiering og sårheling, og intergrin α6 (CD49f), en komponent af α6β4-integritin, var også til stede i betydelige mængder i AM-celler . Det er velkendt, at α6β4-βIG-H3-interaktionen spiller en vigtig rolle i formidlingen af celleadhæsion og sårreparations-signalveje .

En anden vigtig undersøgelse af Baharvand et al. fokuserede på analysen af epithel-benyttet human AM, der viste både kvantitative og kvalitative forskelle sammenlignet med ubehandlet AM . De undersøgte proteomet af det humane AM-epithel, som blev anvendt som limbisk stamcelle-niche til behandling af genopbygning af øjenoverfladen . Der blev påvist 515 pletter i alle 2-DE-geler, og 43 proteiner blev identificeret ved hjælp af MALDI TOF/TOF MS i AM. De mest hyppigt forekommende proteiner var forskellige isoformer af lumican (LUM) og OGN, begge medlemmer af proteoglykanfamilien (PG). Især OGN kan spille en rolle i mange biologiske processer, herunder cellevækst, angiogenese og inflammation . Andre påviste proteiner omfattede kollagen VI α-1/α-2 (Col6a1/Col6a2), fibrinogen betakæde (FGB), transglutaminase 2 isoform A (TGM2A), b-actin variant (ACTB), 70 kD heat shock protein 5 (HSPA5), nidogen 2 (NID2), CD49f, βIG-H3 og tubulointerstitial nephritis (TIN) . Nogle af de proteiner, der blev identificeret i denne undersøgelse, var også relateret til den ekstracellulære matrix (ECM). Blandt de påviste blev fibronectin (FN), lamininer og kollagen IV (Col4) og VII rapporteret til at fremme epiteladhæsion og -migration .

5. Sekretom

For nylig er der gjort betydelige fremskridt med hensyn til analysen af de sekreterede proteiner fra AFSC’er. Det er blevet dokumenteret, at AFSC-sekretomet var ansvarlig for at øge vaskulogenese og var i stand til at fremkalde et stærkt angiogent respons hos murine recipienter . I henhold til denne undersøgelse afslørede en detaljeret analyse af AFSC-konditionerede medier ved hjælp af Luminex’ MAP-teknologi tilstedeværelsen af kendte proangiogene og antiangiogene faktorer. Vascular endothelial growth factor (VEGF), stromal cell-derived factor 1 (SDF-1), interleukin 8 (IL-8), monocyte chemotactic protein 1 (MCP-1) og to angiogenesehæmmere, interferon-gamma (IFNγ) og interferon gamma-induceret protein 10 (IP-10), blev identificeret som sekreterede proteiner . Det blev også påvist, at et relativt lille antal AFSC var tilstrækkeligt til at udskille en påviselig mængde proangiogene vækstfaktorer og cytokiner. Sekretionen af disse kan reguleres på en dosisafhængig måde i overensstemmelse med det oprindelige celletal af de anvendte celler .

En systematisk undersøgelse af AFSC-sekreterede proteiner førte til den konklusion, at proangiogene opløselige faktorer fra AFSC’er kan formidle rekruttering af endotheliale progenitorer i en iskæmisk rottemodel . Især kunne konditioneret medium fra AFSC’er topisk levere angiogene vækstfaktorer og cytokiner til hudlappen i den iskæmiske rottemodel og var ansvarlig for at udløse den endogene reparation ved at rekruttere endotheliale progenitorceller .

I vores seneste undersøgelser undersøgte vi det terapeutiske potentiale af AF-MSC’er og deres sekreterede molekyler i mus med akut leversvigt . En række cytokiner og vækstfaktorer blev påvist i AF-MSC konditioneret medium. Der blev påvist cytokiner såsom interleukin 10 (IL-10), interleukin 27 (IL-27), interleukin 17-familien (IL-17E), interleukin 12p70 (IL-12p70), interleukin-1 beta (IL-1β) og interleukin-1 receptor antagonist (IL-1ra), der er ansvarlige for at inducere lokal og systemisk nedregulering af proinflammatoriske mediatorer. SERPINE1, MCP-1 og SDF-1, der er ansvarlige for at fremme vævsreparation, blev også udskilt . Interessant nok var blandt de stærkt udtrykte vækstfaktorer platelet-derived endothelial cell growth factor (PD-ECGF), endostatin/collagen XVII (EN/Col17), urinplasminogenaktivator (uPA), TIMP1, TIMP2, heparin-bindende EGF-lignende vækstfaktor (HB-EGF), fibroblast growth factor 7 (FGF7) og epidermal growth factor (EGF), der er ansvarlig for leverregeneration og vævsreparation .

6. Sammenfatning

De nuværende data indtil videre tyder på, at fostervand og fostermembran kan udgøre lovende kilder til stamceller af mesenkymal oprindelse. MSC’er er nemlig mere rigeligt forekommende, og der er beskrevet en lang række protokoller til deres isolering. Det er imidlertid rapporteret, at forskellige kulturbetingelser for den samme celletype kan påvirke deres differentielle genekspressionsmønster, hvilket udgør en begrænsning for deres isolering og ekspansion in vitro. Undersøgelser, der omfatter fænotypisk analyse ved hjælp af metoder som flowcytometri og immunohistokemi samt transkriptomiske, proteomiske og sekretomiske analyser, har til formål at bestemme proteinprofilen for disse celler (figur 1). Data fra sådanne undersøgelser forventes at kunne klarlægge deres differentielle repertoire og validere den molekylære profil af disse stamceller. Det vigtigste spørgsmål, der skal løses, er imidlertid isolering af en homogen population, som kan lette systematiske undersøgelser med henblik på at klarlægge funktionen af disse multipotente celler.

Sådanne tilgange kan føre til identifikation af nøgleantigener, der afspejler disse cellers fænotype og forklarer deres særprægede egenskaber. Denne type undersøgelser vil åbne vejen for en systematisk og effektiv isolering af disse celler, inden de anvendes i kliniske omgivelser.

Bilag

Spørgsmål til yderligere undersøgelser

Hvilke er de egnede isoleringsmetoder og dyrkningsbetingelser for AFSC’er eller AMSC’er, der gør det muligt at identificere en konsistent fænotype?

Er der en enkelt markør, der kan bruges til at isolere AFSC’er eller AMSC’er?

AFSC- og AMSC-populationerne er heterogene og adskiller sig fra hinanden i deres fænotypiske og molekylære egenskaber. Metoder til isolering kan resultere i en homogen cellepopulation.

AFSC’er eller AMSC’er kan anvendes som redskaber inden for regenerativ medicin: etablering af kulturbetingelser med minimale eller ingen animalske stoffer.

Marker Discovery
Den indledende karakterisering af AFSC’er og AMSC’er kan udføres ved immunofænotypeanalyse ved hjælp af velkarakteriserede celleoverflademarkører som f.eks: CD90, CD73, CD105, CD29, CD166, CD49e, CD58, CD44, HLA-ABC, SSEA-4; AMSC’er: CD13, CD29, CD44, CD49e, CD73, CD90, CD105, CD117, CD166, Stro-1, HLA-ABC, SSEA-3, SSEA-4, Nanog, Sox2, Tra1-60, Tra1-80, FGF-4, CFC-1 og PROM1.

Transcriptomics og Proteomics afslørede identifikation af nøglemarkører, der blev udtrykt som
AFSC’er: Nanog, Sox2, POU5F1, NF2, IGF2, PLAU, OXTR, HHAT, RCS5, CDC2, COL2, TAGLN, Gsn, Anx4, GSTP, CK-19, Vim, Col1 og Gal; AMSC’er: OGN, βIG-H3 og CD49F.
Da der ikke findes nogen fælles markør for AFSC og AMSC, er det nødvendigt at anvende et bredere panel af markører. Dette opfordrer også til, at der gennemføres yderligere detaljerede array- og funktionelle analyser for at definere de mest hensigtsmæssige markører til karakterisering af AFSC og AMSC.

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen interessekonflikter.