Frontiers in Oncology

Introduktion

Det er kendt, at vedvarende infektion med human papillomavirus med høj risiko (hr-HPV) er en nødvendig årsag til livmoderhalskræft og prækancerøse læsioner (1, 2). Med en afsløret ætiologi kan livmoderhalskræft i høj grad forebygges (3, 4). Udviklede lande er begyndt at anvende hr-HPV-testning i primær screening for livmoderhalskræft, enten alene eller sammen med cytologi (5-8). Der er dokumentation for, at HPV-baserede screeningsprogrammer giver større beskyttelse mod livmoderhalskræftforstadier og -kræft end andre traditionelle screeningsmetoder, som f.eks. cytologi (9-11). Da de fleste HPV-infektioner imidlertid kan udslettes spontant, identificerer HPV-testning mange infektioner, som ikke udvikler sig til livmoderhalsforstadie eller -kræft, især hos unge kvinder (12). Derfor anbefales HPV-DNA-test ikke til screening af kvinder under 30 år. Desuden kan HPV-positive patienter, der henvises til efterfølgende procedurer, blive udsat for unødvendige invasive indgreb.

I Kina var der 98 900 nye tilfælde og 30 500 dødsfald som følge af livmoderhalskræft i 2015 (13). For at dæmme op for den stigende tendens til denne malignitet har den kinesiske regering siden 2009 tilbudt et landsdækkende gratis screeningsprogram for livmoderhalskræft til kvinder, der bor i landdistrikterne, ved hjælp af VIA/VILI, Papanicolaou (Pap)-test eller HPV-test (i pilotområder), baseret på økonomisk og teknologisk udviklingsniveau (14). På grund af disse screeningsmetoders karakter er det imidlertid nødvendigt at forbedre den diagnostiske nøjagtighed. I betragtning af Kinas store befolkning bør der desuden evalueres et nyt screeningsværktøj med en balance mellem følsomhed og specificitet.

Disseasespecifikke molekylære markører for livmoderhalskræft giver en kombination af høj følsomhed og høj specificitet til påvisning af livmoderhalskræftprækræft. De fleste af disse markører blev identificeret på grundlag af mekanismen for HPV-relateret carcinogenese. HPV-RNA-testen er baseret på påvisning af HR-HPV E6 og E7 mRNA. Det onkogene potentiale ved HPV-infektion afhænger af produktionen af virale E6/E7-onkoproteiner. Således giver påvisning af E6/E7 mRNA-transskriptioner mulighed for en specifik test til påvisning af prækancerøse læsioner.

I denne undersøgelse evaluerede vi den kliniske ydeevne af HPV E6/E7 mRNA-testen til påvisning af højgrads cervikal intraepithelial neoplasi (CIN) og kræft blandt kinesiske kvinder.

Materialer og metoder

Deltagere og procedurer

Denne hospitalsbaserede undersøgelse blev gennemført i løbet af april til december 2017 i Henan-provinsen, Kina. Kvinder, der besøgte afdelingen for gynækologi på The Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University (SAHZU) til kolposkopi, blev inviteret. Inklusionskriterierne var som følger: (1) kvinder i alderen mellem 25 og 64 år; (2) ingen historie af livmoderhalskræft eller hysterektomi; (3) ingen kliniske symptomer på graviditet eller 8 uger efter afbrydelse af graviditet; og (4) forstår undersøgelsesprocedurerne og deltog frivilligt. Undersøgelsen blev godkendt af Institutional Review Board (IRB) på Henan Cancer Hospital (HCH). Der blev indhentet skriftligt informeret samtykke fra hver deltager.

De cervikale eksfolierede celler blev indhentet fra kvinder under den gynækologiske undersøgelse. Prøven blev opbevaret i 20 ml PreservCyt® transportmedium (Hologic Inc., Marlborough, MA, USA) og opbevaret ved 4 °C. Derefter blev der foretaget kolposkopiundersøgelse af en gynækolog. Kvinder med unormale kolposkopifund blev underkastet en læsionsbestemt biopsi. Hvis kolposkopiundersøgelsen var utilfredsstillende (squamocolumnar junction var ikke helt synlig), blev der foretaget en endocervikal curettage (ECC). Prøver af exfolierede celler fra livmoderhalsen blev transporteret til Cancer Institute and Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences (CICAMS). Prøverne blev opdelt i to portioner: en 1,5 ml celleblanding i et EP-rør til HR-HPV-DNA-test og HPV E6/E7 mRNA-test. Den resterende bevaring med eksfolierede celler blev anvendt til ThinPrep cytologisk test (TCT) (Hologic Inc., Marlborough, MA, USA). Bethesda-rapporteringssystemet blev anvendt til cytologi af en ledende cytolog (15).

HR-HPV DNA Assay

De 400 μl celleblandingsprøver fra 1,5 ml EP-rør blev anvendt til påvisning af DNA af 14 hr-HPV-typer (16, 18, 31, 33, 33, 35, 39, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 og 68) ved hjælp af Cobas 4800 HPV assay (Roche, Basel, SUI). Den rapporterede det samlede resultat af de 14 hrHPV-typer og det separate resultat for HPV 16 og 18 samtidig (16). Cobas 4800 var en PCR-baseret test for HPV-DNA med nukleinsyrehybridiseringsamplifikation i henhold til producentens anvisninger. Der blev fastsat negative og positive kvalitetskontroller i hver test. Hvis ct-værdien var større end 40, blev resultatet anset for at være negativt. I modsat fald blev resultatet betragtet som positivt. De positive resultater omfattede tre typer: HPV 16, HPV 18 og HPV andre (31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66 og 68).

HPV E6/E7 mRNA-testning

Et ml prøver fra 1,5 ml EP-rør blev anvendt til påvisning af E6/E7 viralt mRNA fra 14 hr-HPV-typerne i den samlede APTIMA HPV-test (Hologic Inc, Marlborough, MA, USA), i henhold til producentens anvisninger (17). Det var en test i tre trin, herunder mRNA-ekstraktion, forstærkning og påvisning af forstærket produkt. Hvis kopitallet var større end eller lig med 1,0, blev resultatet anset for at være positivt. I modsat fald var resultatet negativt.

Histopatologisk diagnose

Biopsi- og ECC-væv blev sendt til SAHZU med henblik på histopatologiske diagnoser i henhold til rapporteringssystemet for cervikal intraepithelial neoplasi (CIN). Derefter gennemgik histopatologer fra HCH alle objektglasene. Enhver uoverensstemmende patologisk diagnose blev sendt til CICAMS med henblik på bedømmelse. Den endelige diagnose for hver kvinde blev baseret på den dårligste læsning fra panelets gennemgang. Al påvisnings- og diagnoseprocessen var blind.

Statistisk analyse

Den endelige histopatologiske diagnose blev anvendt som guldstandard. Kvinder med TCT-diagnose af low-grade squamous intraepithelial lesion (LSIL) eller værre (LSIL +) blev anset for at være væskebaseret cytologi (LBC) positiv. HPV-DNA-resultaterne blev stratificeret i henhold til HPV-typerne: HPV16/18 (dvs. HPV16- og/eller HPV18-positive), HPV-andre (dvs. alle de 12 HR-HPV-typer positive, undtagen HPV16 og HPV18) og HPV-total (dvs. alle de 14 HR-HPV-typer positive). Der blev beregnet absolutte estimater og 95 % fortrolige intervaller (95 %CI) for positive satser, sensitivitet, specificitet, positiv prædiktiv værdi (PPV) og negativ prædiktiv værdi (NPV). Forskellene i HPV mRNA-ekspressioner i forskellige HPV-grupper blev beregnet ved hjælp af chi-square-test eller Fisher’s exact-test. McNemar-testen blev anvendt til at identificere forskellene i sensitivitet og specificitet. α-niveauet blev sat til 0,05, og p < 0,05 (tostørrelse) blev anset for statistisk signifikant.

Resultater

I alt blev 537 kvinder inkluderet i denne analyse. Gennemsnitsalderen var 43,88 ± 10,97 år. LBC-diagnoserne var: 183 (34,7%) normale, 135 (25,1%) atypiske pladecelleceller af ubestemt betydning (ASC-US), 22 (4,1%) atypiske pladecelleceller kan ikke udelukke HSIL (ASC-H), 7 (1.3%) atypisk kirtelcelle (AGC), 82 (15,3%) LSIL, 75 (14,0%) højgrads squamøs intraepithellæsion (HSIL), 31 (5,8%) pladecellekarcinomer (SCC) og 2 (0,4%) adenocarcinom in situ (AIS). De histopatologiske diagnoser var 298 (55,5 %) normale, 30 (5,6 %) cervikal intraepithelial neoplasi grad 1 (CIN1), 48 (8,9 %) CIN2, 111 (20,7 %) CIN3, 43 (8,0 %) SCC og 7 (1,3 %) AIS.

Tabel 1 viste sammenhængen mellem mRNA- og DNA-detektion efter HPV-typer. Den samlede overensstemmelse mellem de to test var 90,7 % (95 %CI: 87,9, 92,9) med en kappa-værdi på 0,81. De positive satser for mRNA var henholdsvis 91,7 %, 84,6 % og 86,4 % hos HPV16/18-, HPV-andre- og HPV-total-positive kvinder. Alle de positive mRNA-rater var højere hos HPV-positive kvinder end hos HPV-negative kvinder i samme HPV-type gruppe (alle p < 0,001).

Den positive HPV-DNA-, mRNA- og LBC-rate steg med sværhedsgraden af den histopatologiske diagnose og varierede fra henholdsvis 25,5, 19,1 og 11,4 % i normal til 100,0 % i SCC. De positive satser for de tre test i AIS var henholdsvis 85,7, 85,7 og 100,0 %. Disse tre test havde lignende positive satser i CIN3, SCC og AIS. Men de positive satser for mRNA var relativt lavere hos kvinder med CIN2-diagnose. HPV16-positivprocenterne var de højeste i CIN3, SCC og AIS sammenlignet med andre HPV-DNA-grupper. HPV18-positive satser var lavere end 7 % i alle pladecellelæsioner, men lidt højere (28,6 %) i AIS (tabel 2).

Tabel 3 viste de tre testers kliniske ydeevne med hensyn til påvisning af CIN2+- og CIN3+-læsioner. Sensitiviteten for mRNA til påvisning af CIN2+ og CIN3+ var henholdsvis 93,8 % (95 %CI: 89,7-96,4) og 95,7 % (95 %CI: 91,3-97,9), hvilket ikke var forskelligt fra dem, der påvises ved hjælp af DNA (95,7 % for CIN2+, 96,3 % for CIN3+), men højere end dem, der påvises ved hjælp af LBC (80,4 % for CIN2+ og 88,8 % for CIN3+). Specificiteterne for mRNA til påvisning af CIN2+ (79,0 % ) og CIN3+ (70,5 % ) var signifikant højere end dem, der påvises ved DNA (71,0 % for CIN2+, 62,8 % for CIN3+) (p < 0,05), men lavere end dem, der påvises ved LBC (84,5 % for CIN2+, 79,8 % for CIN3+). PPV’erne for mRNA til påvisning af CIN2+ og CIN3+ var 74,0 % (95 %CI: 68,4-78,9) og 58,1 % (95 %CI: 52,1-63,9), og NPV’erne var henholdsvis 95,2 % (95 %CI: 92,0-97,2) og 97,4 % (95 %CI: 94,8-98,8).

Tabellerne 4, 5 viste de positive satser og den kliniske ydeevne for de tre test i forskellige aldersgrupper. Sammenfattende viste alle testene en bedre præstation for kvinder over 30 år end yngre kvinder. HPV DNA-testen havde den højeste sensitivitet, og LBC havde den højeste specificitet med hensyn til påvisning af CIN2+ og CIN3+ hos kvinder under 30 år.

Diskussion

De fremlagte resultater viste, at mRNA-testen og DNA-sutten opnåede en høj overensstemmelse på 90,7 %. HPV DNA-, mRNA- og LBC-positivprocenterne steg med sværhedsgraden af den histopatologiske diagnose, fra henholdsvis 25,5, 19,1 og 11,4 % i normale tilfælde til 100,0 % i SCC tilfælde. Sensitiviteten for mRNA til påvisning af CIN2 og CIN3+ var 93,8 % og 95,7 %, hvilket svarede til dem, der blev påvist ved hjælp af DNA (95,7 % for CIN2+ og 96,3 % for CIN3+). Men specificiteterne for mRNA (79,0 % for CIN2+ og 70,5 % for CIN3+) var betydeligt højere end dem, der blev påvist ved hjælp af DNA (71,0 % for CIN2+ og 62,8 % for CIN3+).

I denne undersøgelse viste HPV E6/E7 mRNA-testen og HPV DNA-testen høj overensstemmelse. Af de HPV 16/18 DNA-positive kvinder var 91,7 % også positive på mRNA, hvilket svarer til andre undersøgelser, der rapporterede en samlet overensstemmelse på over 90 % mellem APTIMA HPV-test og HPV DNA-test (17, 18) og konsekvent højere positive satser for HPV DNA-test i forskellige populationer (19, 20). Vi bemærkede højere positive satser hos ældre kvinder end hos yngre kvinder, hvilket var lidt anderledes end i andre undersøgelser (21-23). Denne variation kan tilskrives undersøgelsesdesignet (dvs. en hospitalsbaseret undersøgelse), hvilket begrænser ekstrapoleringen af resultaterne til den generelle befolkning. Interessant nok var diskordansraten højere hos kvinder i alderen 30 år eller yngre (25,6 % vs. 8,6 %). Undersøgelser har vist en højere rate af spontan clearance for HPV-infektion hos yngre kvinder, hvilket indikerede en lavere mulighed for HPV-integration (24).

Som bekendt påviser DNA-baserede HPV-tests tilstedeværelsen eller fraværet af HPV-DNA. De fleste HPV-infektioner er imidlertid forbigående og forsvinder spontant inden for 1 år, hvilket ikke ville udvikle sig til livmoderhalsforstadie eller -kræft (25). E6/E7 mRNA-ekspression forekommer kun i aktivt inficerede celler og øges under udvikling og progression af CIN (26). Derfor formodes HPV mRNA-testen at være mere specifik med hensyn til påvisning af højgradige cervikale læsioner. Vores data bekræftede denne hypotese. Vi fandt, at mRNA-testen var lige så følsom som DNA-testen, men mere specifik med hensyn til påvisning af livmoderhalskræftforstadier og -kræft. Andre forskere har draget lignende konklusioner enten i forbindelse med primær screening (20) eller triage af kvinder med mindre unormale cytologier (27). I vores undersøgelse havde 50 kvinder uoverensstemmende resultater mellem HPV DNA- og mRNA-test. Blandt dem blev 34 DNA + /mRNA- mod 8 mRNA + /DNA- diagnosticeret som normale eller CIN1; 6 mod 2 blev diagnosticeret som CIN2 eller CIN3; der blev ikke observeret nogen testforskel i kræft. Hvis vi erstatter HPV-DNA-testen med mRNA-testen, ville 34 kvinder derfor ikke blive henvist til unødvendig kolposkopi, men 4 CIN2 og 2 CIN3 ville blive overset. På trods af 6 manglende tilfælde gik der ingen sensitivitet tabt, men specificiteten steg. Litteraturen viste, at 40-60 % af CIN2-tilfælde ville regrediere inden for 2 år (28, 29), og ikke alle CIN3-tilfælde var ægte prækancerøse læsioner (30). Cook et al. fandt også en lav CIN2+-rate blandt mRNA-/DNA+-kvinder (17). Derfor var risikoen for invasiv kræft for de 6 kvinder lav i et kort tidsinterval.

Vi evaluerede også testens ydeevne hos ældre og yngre kvinder. Den aldersspecifikke analyse viste, at de tre test fungerede bedre hos kvinder, der var ældre end 30 år. Baseret på det faktum, at yngre kvinder med CIN-læsioner havde en højere mulighed for regression, foreslår vi en konservativ behandling af yngre kvinder. Undersøgelser har vist, at HPV-infektion var almindelig hos unge kvinder, men en stor del af dem var forbigående infektioner, og de kan forsvinde spontant (31, 32). Den korte varighed af de fleste HPV-infektioner hos disse kvinder tyder på, at den tilknyttede cervikale dysplasi bør håndteres konservativt (12). Derfor er HPV-DNA-testen måske ikke en egnet screeningsmetode til kvinder under 30 år på grund af den høje falsk-positive rate. Screeningsevnen af cytologi og E6/E7 mRNA omfattende hos unge kvinder bør evalueres. I vores undersøgelse viste dataene, at cytologi havde den højeste specificitet hos kvinder under 30 år, men at følsomheden er lavere end HPV-DNA-testen. For E6/E7 mRNA havde den imidlertid en moderat ydeevne hos kvinder under 30 år, som havde højere følsomhed end cytologi ledsaget af højere specificitet end HPV DNA, hvilket tyder på, at E6/E7 mRNA-testning kan være en lovende mulighed for screening af kvinder under 30 år.

Selv om den kinesiske Food and Drug Administration godkendte tre profylaktiske HPV-vacciner (dvs. Cervarix, Gardasil og Cecolin), er forebyggelse af livmoderhalskræft stadig afhængig af screening. I 2009 lancerede den kinesiske regering en landsdækkende gratis screening for livmoderhalskræft for kvinder i landdistrikterne. I 2015 blev HPV-DNA-testen for første gang anvendt som et primært screeningsredskab på pilotområder. På grund af den store befolkning ville HPV-DNA-baseret screening imidlertid resultere i uundgåelige enorme falske positive resultater, hvilket ville føre til spild af sundhedsressourcer og unødvendig angst. Det er lovende, at mRNA kan anvendes i det nationale screeningsprogram for livmoderhalskræft for at reducere de falsk positive uden at miste følsomhed.

Der bør tages højde for flere begrænsninger i denne undersøgelse. For det første er dette en tværsnitsundersøgelse, og vi kunne ikke evaluere risikoen for læsionsprogression i forbindelse med HPV E6/E7 mRNA. Vi stratificerede dog vores data efter histologisk grad, hvilket giver oplysninger om sammenhængen. For det andet er det vigtigt at bemærke, at resultaterne ikke kan generaliseres fuldt ud til den generelle befolkning, fordi undersøgelsens deltagere blev rekrutteret fra ambulatoriet på hospitalet.

Konklusionen er, at APTIMA mRNA-testen havde god overensstemmelse med Cobas 4800 HPV DNA-test med lignende følsomhed og højere specificitet til at påvise højgrads cervikale læsioner. Det er lovende, at mRNA kan anvendes i Kinas nationale screeningsprogram for livmoderhalskræft for at reducere falsk positive resultater uden at miste nogen følsomhed. Der er behov for yderligere undersøgelser for at evaluere den kliniske ydeevne af mRNA-testen hos yngre kvinder i Kina.

Data Availability Statement

Alle datasæt genereret til denne undersøgelse er inkluderet i artiklen/det supplerende materiale.

Ethisk erklæring

Studierne, der involverer menneskelige deltagere, blev gennemgået og godkendt af den rolle, som co-ekspression af HPV E6/E7 mRNA og p16/Ki-67-protein spiller i forudsigelse af risikoen for livmoderhalskræft. af den etiske gennemgangskomité for biovidenskab ved Zhengzhou University. Patienterne/deltagerne gav deres skriftlige informerede samtykke til at deltage i denne undersøgelse.

Author Contributions

S-KZ bidrog til designet og skrev manuskriptet. ZG bidrog til manuskriptets udarbejdelse og revision. PW, M-MJ og P-PG bidrog til undersøgelsen og HPV-DNA-testen. L-NK og Z-NW bidrog til HPV mRNA-testen. D-MZ bidrog til cytologisk og histologisk undersøgelse. QC og X-QC udførte den statistiske analyse. X-BS bidrog til at udtænke undersøgelsen og assisterede med de statistiske analyser. Y-LQ og J-GZ hjalp med at udtænke undersøgelsen og medvirkede ved udarbejdelsen af manuskriptet. J-GZ hjalp med gennemførelsen af undersøgelsen. Alle forfattere læste og godkendte det endelige manuskript.

Funding

Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China (Grant No. 81502475) og Science and Technology Project of Henan Province (Grant No. 172102310067).

Interessekonflikter

Forfatterne erklærer, at forskningen blev udført uden kommercielle eller finansielle relationer, der kunne opfattes som en potentiel interessekonflikt.

Akkreditering

Alle kvinder, der deltog i denne undersøgelse, takkes for deres deltagelse. Vi værdsætter også bidraget fra alle relevante læger til denne undersøgelse og hjælpen fra National Cancer Center, Cancer Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, og Peking Union Medical College. Vi værdsatte også 32nd International Papillomavirus Conference (IPVC 2018) for at give en platform til at præsentere abstraktet af undersøgelsen (titel: Klinisk ydeevne af HPV E6/E7 mRNA-test til påvisning af cervikal højgrads intraepithelial neoplasi og kræft: A Hospital-based Study in China, IPVC8-0744 Poster Session).

Abkortninger

hr-HPV, human papillomavirus med høj risiko; VIA/VILI, visuel inspektion med eddikesyre/visuel inspektion med Lugols jodopløsning; Pap, papanicolaou; SAHZU, Second Affiliated Hospital of Zhengzhou University; IRB, Institutional Review Board; HCH, Henan Cancer Hospital; CICAMS, Cancer Institute and Hospital Chinese Academy of Medical Sciences; 95 %CI, 95 % fortrolige intervaller; ECC, endocervikal curettage; TCT, ThinPrep cytologisk test; CIN, cervikal intraepithelial neoplasi; LSIL, low-grade squamous intraepithelial lesion; HSIL, high-grade squamous intraepithelial lesion; LBC, væskebaseret cytologi; PPV, positiv prædiktiv værdi; NPV, negativ prædiktiv værdi; ASC-US, atypiske pladeceller af ubestemt betydning; ASC-H, atypiske pladeceller kan ikke udelukke HSIL; AGC, atypiske kirtelceller; SCC, pladecellekarcinomer; AIS, adenocarcinom in situ.