Evaluering af denitrificerende bakteriers mikrobielle diversitet i en batchreaktor

BIOPROCESS ENGINEERING

Evaluering af denitrificerende bakteriers mikrobielle diversitet i en batchreaktor

S. I. MaintinguerI,*; I. K. SakamotoII; M. A. T. AdornoII; M. B. A. VarescheII,*

ABSTRACT

Mikrobielle samfund i et industrielt aktiveret slamanlæg kan bidrage til denitrificeringsprocessen, men oplysningerne om de mikroorganismer, der findes i denitrificerende reaktorer, er stadig sparsomme. Fjernelse af uorganiske kvælstofforbindelser kan opnås ved at tilsætte kulstofkilder til den biologiske denitrifikationsproces. Ethanol er et økonomisk rentabelt alternativ som kulstofkilde i tropiske lande som Brasilien, hvor der i stor skala produceres sukkerrør. I denne artikel rapporteres om en vellykket anvendelse af aktiveret slam med nitrat og ethanol i en batch anaerob reaktor. Operationen varede 61,5 timer med et samlet forbrug af nitrat på 42,5 timer, nitritgenerering (2,0 mg/L) og ethanolforbrug (830,0 mg/L) på 23,5 timer. Antallet af denitrifikationsceller i form af det mest sandsynlige antal i starten af driften var lavere end i slutningen, hvilket bekræfter inokulumets evne fra aktiveret slam til denitrifikationsprocessen. Prøverne fra celletællingerne blev identificeret som Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. og uopdrættede bakterier. Disse arter kan derfor være involveret i nitratreduktion og ethanolforbrug i batchreaktoren.

Søgeord:

INDLEDNING

Mikroorganismer, der er i stand til denitrifikation, er vidt udbredt i naturen: jord, sediment, ferskvand, hav og spildevandsbehandlingssystemer (Park & Yoo, 2009).

Mange inokula fra husholdnings- og industrielle rensningsanlæg kan indeholde denitrifikationsbakterier, hovedsagelig i aktiverede slamsystemer (Liu et al., 2006; Daniel et al., 2009), hvor den biologiske kvælstoffjernelse sker for at fremme denitrifikation, dvs. at under heterotrofe anoxiske forhold fungerer de organiske kulstofkilder som elektrondonorer og reducerer nitrat til kvælstofgas (Canto et al., 2008). Tilstedeværelsen af organisk kulstof og energikilder er nødvendig for heterotrof denitrifikation (Nava et al., 2010).

De fleste denitrifikationsbakterier er omfattet af Proteobacteria Phylum, herunder bl.a. Acidovorax, Comamonas og Acinetobacter. Sådanne bakterier kan være til stede i affaldsbehandling, især i aktiverede slamsystemer, som er i stand til at danne molekylært kvælstof fra nitrat og en eksogen kulstofkilde, f.eks. ethanol. Den fuldstændige denitrifikation, dvs. omdannelse af nitrat til kvælstofgas, sker ved hjælp af bakteriearter, der normalt bruger ilt fra luften som energikilde (aerob respiration), men de har også evnen til at bruge nitrat og nitrit i stedet for ilt (anoxisk tilstand). Disse bakterier kan således vokse aerobt i fravær af nitrat eller under anoxiske forhold i tilstedeværelse af nitrat. Omdannelsen af nitrat til molekylært kvælstof er også kendt som anoxisk respiration (Park & Yoo, 2009).

Der er blevet anvendt en lang række organiske forbindelser som f.eks. methanol, ethanol, glukose, acetat, aspartat eller myresyre og aromatiske forbindelser (Queiroz et al., 2011). De fleste af de offentliggjorte undersøgelser vedrørende denitrifikation af drikkevand omfatter dog brugen af methanol, ethanol og eddikesyre (Park & Yoo, 2009). Ethanol (Daniel et al., 2009), glukose og acetat er nogle af de eksterne elektrondonorer, der med succes er blevet anvendt til denitrifikation. Især i Brasilien er ethanol et muligt alternativ (Gavazza dos Santos et al., 2004). Ethanol er blevet produceret i stor skala i Brasilien siden 1975 med det nationale program for alkohol (1975-1985). Brasilien producerer næsten 2,6 x 108 tons sukkerrør, som forarbejdes af 324 sukkerfabrikker til produktion af sukker og ethanol (Borrero et al., 2003). Det produceres i rigelige mængder fra sukkerrør og koster normalt mindre end andre bekvemme kulstofkilder. Ikke desto mindre øger behovet for yderligere elektrondonorkilder til eksogene processer driftsomkostningerne, hvilket muligvis udgør en ulempe for anvendelsen af innovative anaerobe procesbaserede teknologier (Gavazza dos Santos et al, 2004).

De støkiometriske forhold, der beskriver den bakterielle energireaktion (Park & Yoo, 2009), skrives som følger, når ethanol anvendes som kulstofkilde:

0,69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.14 C5H7NO2 +0,43 N2 + 0,67 CO2 + 2,07 H2O

Selv om denne ligning afslører den stoikiometriske mængde ethanol, der kræves til nitratdissimilation, er der behov for yderligere ethanol til deoxygenering og cellesyntese. I praksis anvendes 25-30 % af den nødvendige ethanolmængde til bakteriecellesyntese. Når der er opløst ilt til stede, er ethanolbehovet tilsvarende højere. Derfor er en almindelig arbejdsværdi for vægtforholdet mellem substrat og nitrat (C:N03) næsten 3 (Park & Yoo, 2009).

Der findes kun få referencer om batchreaktorer og denitrifikationsprocessen. Disse konfigurationer kan bruges til at undersøge ernæringsmæssige krav (Maintinguer et al., 2008). Denitrifikationsprocessen med komplekse kulhydrater evalueres i batchreaktorer, fordi det partikulære organiske materiale, der er til stede i disse systemer, kan vanskeliggøre driften i andre konfigurationer, f.eks. med stivelse (Iamamamoto, 2006). Desuden forbliver biomassen tilbage i batchreaktoren i alle driftsperioder sammenlignet med kontinuerlige flowreaktorer. Disse forhold kan bidrage til det samlede nitratforbrug, der er verificeret i batchreaktoren (Etchebehere et al., 2001; Gavazza dos Santos et al., 2004).

Den nitratfjernelse med aktiveret slam inokulum er blevet undersøgt især i lande med tempereret klima. Der er kun få rapporter om undersøgelser af nitratfjernelse og molekylærbiologi med aktiveret slam inoculum fra tropiske lande som Brasilien. I denne henseende var det første mål med vores undersøgelse at evaluere denitrifikationsprocessen med aktiveret slam som inokulum fra tropiske klimaer. Det andet mål med vores undersøgelse var at foretage en mikrobiel karakterisering af inokulumet med henblik på at identificere de potentielle organismer, der specifikt er involveret i denitrifikationsprocessen.

Dette arbejde undersøgte den mikrobielle diversitet af denitrifikation i en batchreaktor fodret med ethanol og nitrat ved hjælp af molekylærbiologiske teknikker og traditionel metodologi i mikrobiologien.

MATERIALE OG METODER

Batchreaktor

Forøget blev udført med slam fra spildevandsrensningsanlæggets aktiverede slamsystem hos Volkswagen São Carlos (São Carlos SP – Brasilien).

Batchreaktorerne blev fremstillet i tre eksemplarer i Duran®-kolber på 2 L, hvor 1 L var reaktionsmedium, 10% (v/v) inokulum (100 mL/L).

Reaktorerne blev udsat for en N2-atmosfære (99,99%) i 20 min efter fordelingen af opløsningerne. Derefter blev de lukket med butylgummipropper, pakket ind og opbevaret ved 25 ºC ± 1 ºC med omrøring ved 120 rpm i 61,5 timer.

Fysisk-kemisk og kromatografisk analyse

Det samlede flygtige tørstofindhold (TVS) og nitratforbruget blev bestemt i henhold til APHA, 2005, spektrofotometrisk. Nitritanalysen blev udført ved flowinjektion (FIA APHA, 2005). De flygtige fedtsyrer og alkoholer blev bestemt ved gaskromatografi i en Shimadzu GC-2010, udstyret med en flammeioniseringsdetektor, autosampler til headspace COMBI-PAL – AOC model 5000 og HP-INNOWAX-kolonne (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm filmtykkelse), i henhold til Maintinguer et al, 2008).

Kvantificering af denitrificerende bakterier

Det mest sandsynlige antal (MPN) af denitrificerende bakterier blev udført ved fem gange fortyndingen i begyndelsen og ved slutningen af driften af batchreaktoren, i henhold til Tiedje (1982), tilpasset til flydende prøver. Celletællingen efter MPN-metoden blev foretaget efter 15 dages inkubation i overensstemmelse med APHA (2005). Kulturmediets sammensætning og de nitrat- og ethanolkoncentrationer, der blev anvendt i MPN-analyserne, svarede til dem, der blev anvendt i batchreaktordriften, som tidligere nævnt.

Molekylærbiologi

Prøverne til analyse af 16S rRNA blev udtaget fra de højeste positive fortyndingstællinger (MPN) af denitrificerende bakterier ved forsøgets afslutning fra batchreaktorerne.

Den samlede genomiske DNA fra prøverne blev erhvervet efter cellelysis med glasperler (Sigma) og phenol-chloroform ekstraktion som tidligere beskrevet af Griffiths et al. (2000) modificeret.

Amplifikationen ved polymerasekædereaktion (PCR) blev udført med et primersæt til bakteriedomænet for 16S rRNA-genet, 27 fremadrettet (5′-AGAGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′) og 1100 omvendt (5′-AGGGTTTTGCGCTCGTCGTTG-3′) (Lane, 1991). PCR-amplifikationen (Thermo cycler Eppendorf AG – Hamburg 22,331) blev udført med indledende denaturering ved 94 ºC i 5 minutter efterfulgt af 30 cyklusser med denaturering ved 94 ºC i 45 sekunder, annealing ved 55 ºC i 45 sekunder, forlængelse ved 72 ºC i 1,45 minutter og endelig forlængelse ved 72 ºC i 7 minutter og afkøling ved 4 ºC.

Prøver af PCR-produkter (polymerasekædereaktion) (16S rRNA) blev klonet ind i plasmidvektoren pGEM (Promega Easy Vector System I) i overensstemmelse med producentens specifikationer. Klonerne blev tilfældigt udvalgt og amplificeret ved PCR. Nukleotidsekventering blev udført på en automatiseret ABI 310 PRISM-sekventeringsmaskine (Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) i overensstemmelse med producentens anvisninger ved hjælp af en M13 fremadrettet primer (50-GTAAAA CGA CGG CCG CCA G-30) (Messing, 1983). PCR-amplifikationen (Thermo cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) blev udført med indledende denaturering ved 94 ºC i 2 minutter efterfulgt af 25 cyklusser med denaturering ved 94 ºC i 1 minut, annealing ved 55 ºC i 1 minut, forlængelse ved 72 ºC i 1 minut, og endelig forlængelse ved 72 ºC i 7 minutter og afkøling ved 4 ºC.

Nukleotidsekvenserne blev behandlet, og de blev justeret med programmet Seqman (Lasergene DNAstar-pakken) for at fjerne signalerne fra vektoren og baser af lav kvalitet. De justerede sekvenser blev bestemt ved hjælp af BLAST-søgningsprogrammet på NCBI-webstedet sammenlignet med sekvenserne af 16S rRNA-genorganismer, der er repræsenteret i databasen Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) og Ribosomal Data Base Project (http://rdp.cme.smu.edu). Det fylogenetiske træ blev konstrueret ved hjælp af Neighbor-Joining-metoden (Saitou & Nei, 1987) ved hjælp af programmet MEGA version 4.1 (Kumar et al., 2008). Bootstrap resampling-analyse for 1000 gentagelser blev udført for at estimere træets topologiers tillid. De kendte sekvenser af Aspergillus niger (FJ828924.1) blev tilføjet, og den blev brugt som out-group.

RESULTATER OG DISKUSSION

Nitraten blev fuldstændig forbrugt efter 42,5 timers drift (figur 1). Nitritdannelsen blev reduceret (2,0 mg/L ved 18,5 timer) og fandt sted inden for 23,5 timer efter driften. Der blev observeret 1,06 g ethanol/L (36 % forbrug) efter 13,5 timers drift for en indledende koncentration på 1 650 mg/L. Ethanolforbruget ved forsøgets afslutning var 54 % (0,77 g/L på 61,5 timer). Disse resultater var næsten identiske med resultaterne fra Gusmão et al. (2006). Forfatterne (op.cit.) observerede 98,9 % af nitratforbruget i 14 timers drift med rensede celler af granulært slam fra et opstrøms anaerobt slamtæppe (UASB), der behandler spildevand fra et fjerkræslagteri (DAKAR-Tietê SP Brasilien), med nitrat (350 N-NO3 mg/L), ethanol (377 mg/L) og benzen (10 mg/L) som kulstofkilder.

Methanol (197,78 mg/L) og n-butanol (23,50 mg/L) blev påvist ved forsøgets start. Disse alkoholer (metanol og n-butanol) var muligvis til stede i inokulumet. Koncentrationen af alkoholerne viste ringe variation indtil forsøgets afslutning, hvilket tyder på, at de ikke blev forbrugt under denne denitrifikationsbetingelse (figur 2).

Den maksimale eddikesyreproduktion var 16,7 mg/L ved 61,5 timers drift. Værdierne for STV ved begyndelsen og ved slutningen af batchreaktorens drift var henholdsvis 5,14 g/L og 11,40 g/L, hvilket indikerer en stigning på 122 % i biomassen. Disse resultater viste, at de driftsbetingelser, der blev pålagt batchreaktoren, gavnede udviklingen og varigheden af bakteriekonsortiet under denitrifikationsbetingelser.

I denne undersøgelse blev denitrifikationsprocessen observeret, som også blev beskrevet af andre forfattere, der anvendte forskellige konfigurationer for reaktorerne.

Callado & Foresti (2001) anvendte anaerobe reaktorer, der blev fodret med syntetisk substrat, der simulerede husspildevand, for at fjerne den største fraktion af kulstofholdigt materiale og for at fremme substratets nitrifikation, denitrifikation og biologisk fosfatfjernelse i samme batchcyklus i en sekventiel anaerob/aerob/anaerob batchreaktor. Systemet blev drevet i 41 dage med 84 cyklusser af 12 timers varighed ved en temperatur på 28 ± 1 ºC. Forfatterne (op.cit.) bemærkede, at denitrifikationen fandt sted under skiftevis aerobe og anoxiske forhold i reaktionsfasen. Begge processer fandt kun sted, når natriumacetat (500 mg/L) blev tilsat i begyndelsen af den anoxiske fase.

Etchebehere et al. (2001) testede acetat (40 mmol/L) og glukose (13 mmol/L) som kulstofkilder til denitrifikation i en anaerob batchreaktor med kaliumnitrat (20 mmol/L) for tre forskellige inokula: slam fra en anoxisk reaktor (laboratorieskala) til fjernelse af kulstof og kvælstof fra perkolatet fra en sanitær losseplads; slam fra en UASB methanogen reaktor til behandling af malt og slam fra en anoxisk reaktor fodret med acetat og nitrat. Nitrat blev fuldstændigt opbrugt fra de tre testede slamprøver, som det blev observeret i denne undersøgelse. Forfatterne (op. cit.) konkluderede, at acetat er en bedre kulstofkilde end glukose.

Gavazza dos Santos et al. (2004) undersøgte denitrifikationsprocessen, der blev udført i batchreaktorer, som blev fodret med syntetisk spildevand, der simulerer nitrificeret spildevand fra rensningsanlæg for husspildevand, ved hjælp af tre elektrondonorkilder: methanol (53,3 mg/L), ethanol (38,3 mg/L) og metan (ud over det syntetiske spildevand). Forfatterne (op.cit.) bemærkede, at den mest effektive elektrondonor var ethanol, som fuldstændigt fjernede nitrit og nitrat, som det også blev observeret i dette arbejde.

Iamamamoto (2006) opnåede en kvælstoffjernelse på over 84 % i en sekventiel batchreaktor, der blev fodret med stivelse og ammonium skiftevis under anoxiske og aerobe forhold (2 timer/2 timer cyklus) og 2 mg O2/L for følgende koncentrationer: 125 mg N-NH4/L og 0,95 g stivelse/L, 250 mg N-NH4/L og 1,9 g stivelse/L, 500 mg N-NH4/L og 3,5 g stivelse/L, 500 mg N-NH4/L og 3,5 g stivelse/L.8 g stivelse/L, med inokulum fra et aktiveret slamsystem på en rensningsstation (Flores da Cunha Rio Claro SP Brasilien). Ethanol (1.500 mg/L) blev også testet som kulstofkilde sammen med 500 mg NH4-N/L. Forfatterne (op.cit.) bemærkede, at nitrit- og nitratfjernelsen var fuldstændig (100 %), som det blev observeret i nærværende undersøgelse, hvilket viser, at det er muligt at anvende ethanol i denitrifikationsprocessen.

Denitrifikationscelleantallet i MPN ved begyndelsen af driften af batchreaktoren var lavere (1,1 x 1010 MPN/mL) end ved slutningen af driften (1,2 x 1019 MPN/mL) (figur 3). Disse resultater er højere end dem, der er rapporteret i litteraturen, og som er beskrevet nedenfor.

Etchebehere et al. (2001) optællede denitrificerende celler efter det mest sandsynlige antal (MPN) i et basalmedium suppleret med gærekstrakt (0,5 g/L), kaliumacetat (1,84 g/L) og kaliumnitrat (0,72 g/L) og opnåede 9,6 x 106 MPN/mL med slam fra den anoxiske reaktor i et perkolatbehandlingsanlæg. Callado og Foresti (2001) anvendte natriumacetat som kulstofkilde i en sekventiel anaerob/ aerob/anaerob batchreaktor og fandt flere MPN denitrifikationsbakterier i begyndelsen af driften (2,5 x 106 MPN/mL) end i slutningen (3,5 x 105 MPN/mL). Forfatterne (op.cit.) konkluderede, at dette fald ikke havde nogen indflydelse på denitrifikationsprocessen.

Iamamamoto (2006) opnåede den samme størrelsesorden i MPN af denitrifikationsbakterier ved slutningen af driften af en sekventiel batchreaktor med 250 mg N-NO3/L (3,9 x 106 MPN/mL) og 500 mg N-NO3/L (1.1 x 106 MPN/mL), begge med tilsætning af stivelse (1.900 mg/L) som kulstofkilde og inokulum fra aktiveret slam fra et spildevandsbehandlingsanlæg (Rio Claro SP – Brasilien).

De denitrificerende bakterier blev begunstiget af den ernæringsmæssige tilstand, der blev pålagt i den anoxiske reaktor. Denne kendsgerning bekræftede, at inokulumet fra aktiveret slam kunne anvendes til denitrifikationsprocessen.

Fifty kloner blev opnået fra den analyserede prøve med henblik på kloning og sekventering af 16S rRNA-genfragmenterne af det mikrobielle konsortium. Kloner med værdier på under 180 nukleotider blev dog ikke indarbejdet i den fylogenetiske analyse, fordi de ikke var tilstrækkelige til at blive sammenlignet med den nedenfor beskrevne database. Sekvenserne fra kloning og sekventering blev opnået fra den MPN-positive prøve med den højeste fortynding (10-18) (tabel 1).

Acinetobacter sp. blev identificeret med ligheder på: 98 % (klon 1, 8, 13, 15, 33, 43, 43, 45, 52, 54, 54, 62, 67, 83 og 2, 4, 18, 20, 23 og 27) og 99 % (klon 6, 15, 16, 37 og 38). Det er en gramnegativ bakterie, ikke-mobil, oxidase-negativ, ikke-fermentativ, parvis og tilhører Proteobacteria Phylum, Moraxellaceae-familien. Det er en vigtig mikroorganisme i jorden, hvor den kan bidrage til mineralisering, f.eks. af aromatiske forbindelser (Geng et al., 2006). Wang et al. (2007) isolerede Acinetobacter-stammer i en prøve fra et aktiveret slamsystem (Jizhuangzi Tianjin – Kina). Denne stamme var i stand til at bionedbryde phenol (1,1 g/L) ved hjælp af frie og immobiliserede celler. Geng et al. (2006) isolerede phenolnedbrydende bakterier i en prøve fra et aktiveret slambehandlingssystem (Singapore). Biokemiske test viste, at disse mikroorganismer kan vokse i nærvær af ethanol, glukose, saccharose og aromatiske forbindelser som f.eks. toluen, phenol og benzoat. Den blev beskrevet som en ny art, Acinetobacter EDP3. Forfatterne (op.cit.) konkluderede, at denne art kan anvendes til at fjerne phenolforbindelser eller til in situ-biosanering af phenol i jord. Cai et al. (2009) identificerede 58 resistente bakterier fra jord, der er forurenet med arsen. Acinetobacter-, Agrobacterium-, Arthrobacter-, Comamonas-, Rhodococcus-, Pseudomonas- og Stenotrophomonas-stammerne blev identificeret i høje koncentrationer (20 mM Ar/L). Acinetobacter sp. identificeret i dette arbejde havde deres vækst på grund af de pålagte driftsbetingelser og kunne bidrage til denitrifikation.

Klonerne 24 og 26 lignede Comamonas sp. med ligheder på henholdsvis 98 % og 97 %. Comamonas er gramnegative bakterier, der hører til Proteobacteria Phylum, Comamonadaceae-familien. Etchebehere et al. (2001) isolerede Gram-negative denitrificerende bakterier fra en anoxisk reaktor, der blev anvendt til behandling af perkolat fra lossepladser i Montevideo (Uruguay). De isolerede arter havde lighed med Comamonas terrigena. Denne mikroorganisme blev imidlertid betragtet som en ny art, der fik navnet Comamonas nitrativorans. Den blev beskrevet som en gramnegativ bakterie, polar flagellum mobil, aerob og kemoorganotrofisk. Denne art voksede i ethanol, acetat og butyrat, nitrat, nitrit og kan reducere nitrat til N2.

Derfor var Comamonas-arter, der blev identificeret i denne undersøgelse, til stede i inokulumet af aktiveret slam og kunne bidrage til den denitrifikation, der fandt sted i forsøgene.

Klonerne 25, 28, 34, 36, 42 og 65 lignede Acidovorax sp. med ligheder på henholdsvis 99 % og 97 % (tabel 1). Acidovorax sp. hører til Proteobacteria Phylum; den findes let i aktiverede slamsystemer. Mange Acidovorax-arter fungerer som regulerende mikroorganismer i mikrobiologiske behandlingsprocesser i aktiverede slamsystemer. Flere Acidovorax-arter anvendes til bionedbrydning af plast og til fjernelse af andre organiske forurenende stoffer, herunder nitrophenoler, nitrobenzen og polychlorerede biphenyler gennem denitrifikation (www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html). Khan et al. (2002) isolerede denitrificerende bakteriearter, der nedbryder PHBV (poly-3-hydroxy-butyrat-co-3-hydroxyvalerat) fra tre aktiverede slamsystemer, der anvendes til behandling af kommunalt spildevand (Nagoya, Osaka og Toyohashi – Japan). De 37 kloner, der blev analyseret, viste lighed med organismer, der tilhører Betaproteobacteria-klassen. De fleste kloner viste lighed med Acidovorax-arten, hvilket bekræftede, at denne art var involveret i nedbrydningen af PHBV under denitrifikationsforhold. Gentile et al. (2007) isolerede lignende arter som Acidovorax, Delftia acidovorans, Pseudomonas, Chryseobacterium og Achromobacter fra en denitrifikationsreaktor, der blev drevet med ethanol (40,0 g/L) og mælkesyre (40,0 g/L) som kulstofkilder; de testede elektrondonorer separat, og nitrat (1,9 g NaNO3/L; 2,3 g KNO3/L) blev anvendt som kvælstofkilde. Forfatterne (op. cit.) konkluderede, at fuldstændig nitratreduktion til N2 blev udført af Acidovorax-arter, mens Achromobacter sp. og Delftia acidovorans var ansvarlige for ufuldstændig nitratdenitrifikation til nitrit. Acidovorax-arter var derfor til stede i de prøver, der blev analyseret i denne undersøgelse, og de kunne være involveret i den denitrifikation, der fandt sted i batchreaktoren.

Ukultiverede bakteriestammer fra Rhodocyclaceae-familien blev identificeret med 98 % lighed (klon 9 – AY945917.1 og kloner 46, 84 AY945905), som vist i tabel 1. Medlemmerne af Rhodocyclaceae-familien er gramnegative bakterier, der tilhører klassen Betaproteobacteria. Det er denitrificerende aerobe stave med en alsidig metabolisk kapacitet. De fleste arter lever i akvatiske habitater og oligotrofe jordbundsforhold. Mange af dem forekommer i spildevand og spiller en vigtig rolle i den biologiske dekontaminering af sådanne steder (http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae). Liu et al. (2006) fodrede en denitrifikationsreaktor med quinolin (40 mg/L), en giftig amin, der anvendes til fremstilling af farvestoffer, pesticider og syntetiske brændstoffer, glukose (180 mg/L), nitrat og kaliumphosphat (C/N/P på 150:30:1). Inokulumet stammede fra den anden sedimenteringstank i spildevandsrensningsanlægget på Industry Shanghai Coking & Chemical Factory (Wujing, Shanghai – Japan). Quinolinfjernelsen var 90,2 % efter reaktorperioden i stationær tilstand (6 uger). Molekylærbiologiske analyser af inokulumet og fra denitrifikationsreaktoren afslørede uopdrættede bakterier, Thauera og Azoarcus i begge forsøg. Ifølge forfatterne var procentdelen af kloner tilknyttet bakterier tilhørende Azoarcus og Thauera henholdsvis 74 % i den denitrifikationsreaktoren og 4 % i inokulumet. Kendskab til mikroorganismer fra miljøprøver er afhængig af laboratorieforhold med renkulturer (Pace, 1997). Imidlertid er mindre end 1% af bakterierne fra forskellige økosystemer kendt (Amann, 1995), eller ca. 99% er ikke blevet undersøgt og identificeret. Derfor forventede vi i dette arbejde at opnå lignende sekvenser af ikke-kultiverede bakterier.

Det fylogenetiske træ, der er opnået med konsensus Bakteriedomænets primere i molekylærbiologiske analyser af forsøget, er illustreret på figur 4.

Lighedskoefficienterne mellem de forskellige grupper af mikroorganismer var 97 % til 99 %, og de indikerede tilstedeværelsen af fylogenetisk beslægtede arter, baseret på 16S rRNA-genets delvise evalueringssekvenser. Kendte sekvenser af arter var fra NCBI-databasen med Aspergillus niger (FJ828924.1) som en ud-gruppe-sekvens af.

Derfor var Acidovorax-, Comamonas- og Acinetobacter-arter identificeret i denne undersøgelse til stede i det aktiverede slamsystem fra Volkswagen São Carlos Motors, og de kunne være involveret i nitratreduktionen og ethanolforbruget.

KONKLUSIONER

Potentialet af inokulumet fra et aktiveret slamsystem og brugen af ethanol som kulstofkilde i en denitrifikationsproces er blevet påvist i en batchreaktor.

De MPN-værdier for denitrificerende bakterier, der blev opnået i denne undersøgelse, kombineret med resultaterne for fjernelse af nitrat, viste, at der var denitrificerende bakterier i inokulumet fra et aktiveret slamsystem, som blev begunstiget af de pålagte næringsbetingelser.

De identificerede kloner havde fylogenetisk tilhørsforhold i Proteobacteria-fylum, Alphaproteobacteria og Gamaproteobacteria-klassen, med Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. og uopdyrkede bakterier. Disse bakterier kunne være involveret i nitratreduktionen og forbruget af ethanol i en anoxisk batchreaktor.

AKUNDERVISNINGER

Forfatterne er taknemmelige for tilskud modtaget fra FAPESP og CNPq.

APHA, AWWA og WEF, Standard methods for the examination of water and wastewater. 22. udgave, American Public Health Association, Washington, DC (2005).

Iamamamoto, C. Y., Nitrogen removal in sequencing batch reactor with suspended biomass treating high ammonia concentration wastewater. Ph.d.-afhandling, University of São Paulo, Brasilien, School of Engineering, University of São Carlos, Brasilien (2006).

Messing, J., Nye M13-vektorer til kloning. Methods in Enzymology, 101 20-78 (1983).

Pace, N. R., A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science, 276, 734-740 (1997).