Differentielle virkninger på membranpermeabilitet og levedygtighed af humane keratinocytter, der udsættes for megasonicfelter med meget lav intensitet

Effekten af eksponering for US med meget lav intensitet (Ispta mellem 7 og 16 mW/cm2, et godt stykke under kavitationstærsklen, 100 mW/cm2) med en frekvens på 1 MHz blev undersøgt på HaCaT-celler. Eksperimenterne blev udført med en tilsvarende medicinsk opsætning, der er skitseret i figur S1 i ESI, ved varierende behandlingsparametre, såsom Ispta, duty cycle og soniceringstid. Foreløbige eksperimenter viste, at temperaturen forblev konstant (inden for 1 °C) inden for de eksponeringsparametre, der er omfattet af denne undersøgelse, bortset fra den termiske dissipation af den amerikanske energi. Desuden viste behandlingerne ikke nogen signifikant afhængighed af de undersøgte virkninger af den amerikanske bølges duty cycle. Disse observationer er i overensstemmelse med den lave US-absorption ved 1 MHz; derimod kan termiske virkninger og duty cycle påvirke celler og væv, der udsættes for højere frekvenser, idet US-dæmpningskoefficienten er proportional med frekvensen23,31.

Resultaterne vil indledningsvis blive præsenteret ved at betragte de to relevante eksponeringsparametre, soniceringstid og Ispta, separat. De strukturelle og fysiske ændringer af cellemembranen (permeabilitet, optagseffektivitet og maksimal størrelse af de internaliserede molekyler) vil blive analyseret og korreleret til den tilsvarende cytotoksiske skade og til den mulige aktivering af inflammatoriske mønstre. Herefter vil resultaterne blive fortolket ud fra soniceringsdosis, defineret som produktet af Ispta og eksponeringstiden, dvs. overfladetætheden af den akustiske energi, der rammer prøven under soniceringen. Faktisk afhænger de undersøgte fænomener af denne størrelse, og dette gjorde det muligt for os at identificere et interval af eksponeringsparametre, hvor der forekommer en forbigående SP med ubetydelige biologiske skader.

Analyse af indflydelsen af US-eksponeringstiden

Forandringer i membranpermeabiliteten hos HaCaT-celler induceret af lavintensivt 1 MHz US blev vurderet i form af optagseffektiviteten af den grøn fluorescerende sonde calcein. Da intakte membraner er uigennemtrængelige for calcein, er det en pålidelig markør for SP. Procentdelen af grøn-positive celler blev kvantificeret ved flowcytometrianalyser i henhold til afsnit 2.5.

For at vurdere følsomheden af membranpermeabilitet over for US-eksponeringstiden blev der anvendt en meget lav US Ispta. Det skal bemærkes, at allerede en Ispta på 7 ± 1 mW/cm2 kan udløse betydelige virkninger på membranpermeabiliteten ved en passende eksponeringstid. Repræsentative resultater af parallelle flowcytometriske undersøgelser af HaCaT- og NIH-3T3-celler, der begge blev soniceret ved Ispta ~7 mW/cm2 i 5′, 15′, 30′ og 45′, er vist i fig. 1 (henholdsvis røde trekanter og blå firkanter). Som forventet resulterer sammenligningen mellem cellelinjerne efter lave soniceringstider (under tærsklen for sonoporation) i en lille affinitet for calcein, hvor forskellene (de største i HaCaT-cellerne) skulle skyldes deres respektive membransammensætnings- og permeabilitetstræk. Endnu vigtigere er det, at begge cellelinjer viser en betydelig stigning i optagelseseffektiviteten fra 15′ eksponering, hvilket svarer til en soniceringsdosis på (6,3 ± 0,9) J/cm2 , hvilket tyder på aktivering af SP-processen. Ifølge de bedste tilpasninger i fig. 1 viser vores eksperimenter for længere eksponeringstider en lineær korrelation mellem optagseffektivitet og eksponeringstid med en identisk optagelseshastighed induceret af US i både HaCaT- og NIH-3T3-celler (lineære regressionshældninger (%/min) 1,3 ± 0,2 og 1,4 ± 0,2 for henholdsvis HaCaT og NIH-3T3). Dette ville betyde, at stigningen i optagseffektiviteten som følge af SP er et cellelinjeuafhængigt fænomen.

For yderligere at undersøge SP-processen og karakterisere internaliseringen blev behandlede HaCaT-celler evalueret ved hjælp af fluorescensmikroskopi. I overensstemmelse med flowcytometri-resultaterne viser prøver soniceret i 5′ ingen signifikante ændringer i membranpermeabiliteten i forhold til kontrolprøven (ubehandlet), mens der fra 15′ observeres en stigende optagseffektivitet (som vist i fig. 2 og figur S2 i ESI), selv om ikke alle celler viste fluorescens. Tilsvarende fremstår cellerne mindre tætte og vedholdende i forhold til kontrolprøven, hvilket tyder på en løsgørelse af de tætte forbindelser. De repræsentative billeder i fig. 2 tyder på en heterogen lokalisering af calcein i cellerne, og faktisk gjorde konfokal fluorescensmikroskopi det muligt at skelne klart mellem den perifere fordeling af sonden og den interne fordeling i HaCaT-cellerne (se billede og 3D-rekonstruktioner i fig. 3). Yderligere detaljerede billeder er vist i afsnit 3 i ESI. Observationerne stemmer overens med en optagelse af fluorsonden på to niveauer: et perifert niveau, hvor sonden er lokaliseret i det endoplasmatiske retikulumnetværk omkring plasmamembranen, og et andet niveau, der er tydeligt efter 30′ eksponering, hvor sondediffusionen ind i cytoplasmaet forårsager en intens fluorescens, der er ensartet fordelt i hele cellen, herunder nukleoplasmaet. Det skal bemærkes, at Stokes-diameteren for calcein er ~1,36 nm, og at dens intranukleære transport ikke hindres af diffusionsbarrierer29. En mere fuldstændig analyse, der er rapporteret i afsnit 3.2 og 3.3, gør det muligt at konkludere, at US-eksponeringsdosis og sondens molekylvægt var dominerende faktorer for optagelsen.

Et andet forsøg baseret på den røde PI-fluorespons blev udført for at vurdere genoprettelsen af den oprindelige membranpermeabilitet i sonicerede celler (se også afsnit 2.3). Internalisering af PI angiver aktivering af cytotoksiske processer. Samlokalisering af de grønne og røde farvestoffer inde i cellerne indikerer derfor, at membrangenoprettelsesprocessen efter SP er mislykket. På den anden side peger observationen af grøn fluorescens i cellerne i fravær af rød fluorescens på, at membranen har været udsat for SP under den amerikanske behandling, og at den er blevet genoprettet efter slukning af feltet. Repræsentative konfokale fluorescensbilleder er vist i fig. 4. Samlokaliseringen af de to farvestoffer er fraværende i de celler, der er behandlet i 15′, mens den næppe er observeret efter 30′ eksponering (figur S5 i ESI). Tilsvarende blev der afsløret et nettotab af levedygtighed på ~5 %, som kontrolleret ved flowcytometri. I de celler, der blev soniceret i 45′, svarende til en dosis på (19 ± 3) J/cm2 , er samlokaliseringen mere tydelig (se hvide pile i fig. 4B), og der forekommer et mere betydeligt tab af levedygtighed (~10 %, som kontrolleret ved flowcytometri). Disse resultater tyder på, at en længere eksponeringstid, der svarer til en højere dosis ved fast Ispta, inducerer en irreversibel ændring i membranstrukturen efterfulgt af et deraf følgende cytotoksisk respons.

Analyse af indflydelsen af US-intensitet

Effekten af at variere intensiteten af det anvendte US-felt på membranpermeabiliteten blev analyseret på HaCaT-cellelinjen efter 15′ eksponering, kort nok til at udelukke virkninger induceret af en langvarig sonicering. I vores undersøgelse lå US-intensiteterne i intervallet mellem Ispta = (7 ± 1) mW/cm2 og Ispta = (16 ± 1) mW/cm2 , hvilket er et godt stykke under kavitationsgrænsen24. I overensstemmelse med den protokol, der er beskrevet i afsnit 2.3 og 2.5, blev FITC-mærkede dextrans med forskellig MW (MW = 10, 40 og 70 kDa) anvendt til for hver US-intensitet at karakterisere induktionen af membranpermeabilitet for de forskellige molekylstørrelser. Denne procedure gør det igen muligt at vurdere sonoporens størrelse. I lighed med calcein trænger dextrans ikke nævneværdigt ind i ubehandlede celler31,32 , mens celleoptagelsen af FITC-mærkede dextrans i kavitations-US-regimet kan øges kraftigt både ved hjælp af SP og ved fremme af endosomtrafikken30. I denne henseende viser resultaterne af flowcytometriske målinger, der er rapporteret i fig. 5, klart en størrelsesafhængig optagelse, et fænomen, der gør det muligt at udelukke, at der samtidig er aktive endocytoseeffekter, og som ifølge litteraturen22 tyder på, at SP udløst ved lav intensitet er den vigtigste mekanisme, der er involveret i transporten af dextranmolekyler gennem plasmamembranen. Specifikt er den observerede SP-inducerede optagelse karakteriseret ved en tærskelværdi Ispta, der stiger lineært med stigningen i MW af de internaliserede molekyler. Under denne tærskelværdi er de behandlede cellers optagseffektivitet sammenlignelig med de ikke-eksponerede cellers. Tærskelværdierne for Ispta er angivet i tabel 1. For intensiteter over tærskelværdien stiger optagseffektiviteten med stigningen i Ispta, indtil et maksimum er nået. For 10 kDa dextran falder den derefter en smule til et plateau. Det observerede fald i optagseffektiviteten ved høje intensiteter kan forklares med stigningen i antallet af døde celler, som fjernes fra prøven ved skylning og således ikke bidrager til flowcytometrianalyserne. Desuden kan aktiveringen af apoptotiske processer hindre internaliseringen af farvestoffet. For Ispta = 15 mW/cm2 , selv om denne værdi er meget lavere end kavitationstærsklen, er cellerne i stand til at internalisere 70 kDa dextrans med en Stokes-diameter på ~12 nm. Denne værdi kan tages som et skøn over den mindste størrelse af de sonoporer, der produceres i membranen. I figur S6 (afsnit 4 i ESI) er der rapporteret et sæt repræsentative fluorescensbilleder, der viser dextransoptagelsen ved tærskelværdien Ispta sammen med PI-testen.

Internaliseringen af PI peger på et signifikant cytotoksisk respons ved Ispta = 15 mW/cm2 (eksponeringsdosis 13,5 J/cm2). Som rapporteret af Udroiu et al.13 under lignende forsøgsbetingelser blev der også observeret en lille, men signifikant stigning i forekomsten af mikrokerner i NIH-3T3-celler, afhængigt af intensiteten og eksponeringstiden for 1 MHz US. Disse observationer antydede, at der var behov for yderligere undersøgelser for bedre at forstå de biologiske virkninger, der ledsager membran-SP, og derfor blev der foretaget en undersøgelse af det biologiske respons på sonicerede celler som en funktion af US-intensiteten.

Det biologiske respons på de SP-inducerede “membransår”, der blev induceret ved meget lave US-intensiteter, blev grundigt karakteriseret ved at evaluere celledøden ved hjælp af det kombinerede AnnexinV- og PI-assay, der er beskrevet i afsnit 2.5 (se også afsnit 5 i ESI). Vi evaluerede også ekspressionen af genet IL-6, et cytokin, der forbinder kronisk inflammation med kræft33,34. Resultaterne fra flowcytometrianalysen, udtrykt i celleprocent, er rapporteret i fig. 6. Celleviabiliteten er hovedsageligt bevaret (>90 %) under 15′ behandlinger, men fra Ispta = 9 mW/cm2 sker der dog et lille fald, ledsaget af en stigning i antallet af tidligt apoptotiske celler. Ved Ispta = 14 mW/cm2 begynder der at blive observeret en betydelig procentdel nekrotiske celler, mens der ved Ispta = 16 mW/cm2 også bidrager sen apoptose til celledøden, hvilket svarer til en lille reduktion af nekrosen (repræsentative flowcytometriske prikplots i figur S7 i ESI). IL-6-genekspression blev bestemt ved RT-PCR (fig. 7). Der blev ikke observeret nogen opregulering for Ispta ≤15 mW/cm2 , mens behandlingen ved 16 mW/cm2 inducerede en overekspression af dette gen i forhold til ubehandlede celler.

Disse resultater tyder på, at med udgangspunkt i en Ispta-tærskelværdi på 16 mW/cm2 og 15′ sonicering, mindsker membranbeskadigelsen forårsaget af US ikke kun cellens levedygtighed, men kan også gennem overekspression af det inflammationsrelaterede gen IL-6 fremkalde et inflammatorisk respons. Da flere undersøgelser har anerkendt, at inflammation spiller en rolle i forbindelse med fremme af patogenese og progression af sygdomme som f.eks. kræft35,36, er der behov for yderligere undersøgelser for bedre at kunne karakterisere de aspekter, der er relateret til inflammatoriske mønstre.

Analyse af soniceringsdosisens indflydelse

For kvantitativt at analysere forholdet mellem det anvendte amerikanske felt og de observerede biologiske virkninger med hensyn til den energi, der blev leveret til cellerne under eksponeringen, blev soniceringsdosis beregnet for hver behandling som produktet af intensiteten Ispta med eksponeringstiden. De opnåede værdier er angivet i tabel 2, hvor de observerede biologiske virkninger er identificeret med baggrundsfarver. Vores resultater tyder på, at membranens SP opstår fra en tærskeldosis på ca. 6,3 J/cm2. Desuden kan størrelsen af sonoporerne sættes i forbindelse med soniceringsdosis. Ved doser på over 10,8 J/cm2 observeres et fald i levedygtighed og samtidig tidlig apoptose i de behandlede celler, efterfulgt af sen apoptose, nekrose og overekspression af IL-6 fra 14,4 J/cm2.

Vi vil gerne understrege, at denne dosis og Ispta 16 mW/cm2 svarer til et negativt spidstryk på ~0,02 MPa. Denne værdi synes høj nok til at inducere mekanisk stress ved grænsefladen mellem plasmamembranen og vandet, selv om den falder en størrelsesorden lavere end den hidtil foreslåede tærskelværdi for sikkerhedseksponering (mekanisk indeks ~0,2-0,3, ved 1 MHz).

Bemærk, at vores eksperimenter blev sammenlignet med succes med dem, der blev udført ved hjælp af et elektromedicinsk system, der faktisk anvendes i amerikansk terapi (se også afsnit 2.2), hvilket understreger den medicinske relevans af vores fremgangsmåde. I denne henseende er vi overbeviste om, at tilvejebringelse af oplysninger om soniceringsdosis (ved den faste US-frekvens) giver mulighed for et mere fuldstændigt indeks for karakterisering af cellernes reaktion på US-eksponering og dermed en fin identifikation af en række parametre, hvor forbigående SP forekommer med ubetydelige biologiske skader.

Et meget vigtigt skridt i retning af at forstå den biologiske indvirkning in vivo af vores resultater ville være at operere US-eksponeringer på tredimensionelle biosystemer, såsom menneskelige væv bestående af flerstammede cheratinocytter eller af blod-hjernebarriere-endothelceller.