Den opdagelse af vandkanaler (Aquaporiner)

Abstract

Bevægelsen af vand ind og ud af celler er en grundlæggende biologisk proces, der er afgørende for livet. En sådan vandbevægelse regulerer ikke kun aktiviteten i de enkelte celler, men er også ansvarlig for funktionen af mange organsystemer og for opretholdelse af hele kroppens vandbalance. Man har længe haft mistanke om, at vandbevægelsen gennem biologiske cellemembraner på en eller anden måde blev forstærket eller lettet af porer eller kanaler, men det har været en lang og besværlig søgen efter at identificere disse kanaler. Som det ofte er tilfældet inden for videnskaben, blev vandkanalens hemmelighed til sidst opdaget ved et tilfælde i 1992 af Peter Agre og hans kolleger på Johns Hopkins University i Baltimore, som arbejdede på røde blodcellers membranproteiner. Denne “første” vandkanal blev oprindeligt kaldt CHIP28 og er nu kendt som aquaporin 1. Agre modtog Nobelprisen i kemi i 2003 for denne opdagelse. Der findes i øjeblikket 13 kendte akvaporiner hos pattedyr, som er fordelt i de fleste væv, men der er blevet identificeret mange flere i lavere organismer og i planteriget. Aquaporiners inddragelse i processer som f.eks. urinkoncentration og kropsvæskens homøostase, hjernefunktion, kirteludskillelse, hudhydrering, mandlig frugtbarhed, hørelse, syn og de fleste vigtige kropsfunktioner, som man kan forestille sig, er nu alle genstand for intensiv videnskabelig undersøgelse. Desuden er defekter i aquaporinfunktionen blevet sat i forbindelse med forskellige sygdomstilstande og patologiske tilstande. Denne korte gennemgang vil diskutere deres baggrund, opdagelse og funktion i udvalgte kropslige processer med særligt fokus på hydrering.

© 2017 Forfatterne Udgivet af S. Karger AG, Basel

Hvorfor er vi interesseret i vandkanaler?

De celler, der udgør vores kroppe, består for det meste af vand. Omkring 65 % af en celle består af vand. Med hensyn til den samlede kropsmasse er babyer de mest “saftige”, idet de består af 75 % vand; magre voksne indeholder 60 % vand, mens ældre voksne kun indeholder 50 % vand. Hovedparten af den tørvægt i kroppen, som ikke er vand, består af knogler. Til sammenligning er den mest vandrige organisme måske salaten (95 % vand), mens vi mennesker kan sammenlignes med en banan (65 % vand). I løbet af evolutionen har cellerne i alle organismer udviklet sig til at fungere optimalt i et sådant vandigt miljø, og betydelige variationer i cellernes indhold af vand vil koncentrere eller fortynde deres molekylære komponenter og forhindre normal funktion. Derfor er cellerne nødt til at regulere den mængde vand, der kommer ind og ud gennem deres plasmamembran, for at regulere den cytosoliske koncentration af opløste stoffer, ioner, elektrolytter, proteiner og nukleinsyrer. Desuden er mængden af vand i de ekstracellulære rum i en organisme også nøje kontrolleret. Hos mennesker og andre pattedyr omfatter dette bl.a. blodvolumen, det interstitielle rum uden for blodkarrene, cerebro-spinalvæsken, vandig humor i øjet og kirtelsekretioner.

Hvorfor har vi brug for vandkanaler?

For at klare de konstant skiftende metaboliske krav og de omgivende forhold skal cellerne hurtigt udveksle vand mellem deres cytoplasma (indeni) og det ydre miljø (udenfor) for at opretholde et konstant volumen. Dette er vigtigt for mange lavere organismer, der har udviklet udførlige mekanismer til regulering af cellens volumen og omfatter normalt ikke kun vandtransport, men også ionflux (hovedsagelig Na+, K+ og Cl-) på tværs af membraner for at genoprette overdreven hævelse eller skrumpning, når de udsættes for eksterne væsker med forskellig osmolalitet (f.eks. fra salt havvand til fortyndet regnvand) . Selv om disse iontransportmekanismer også findes hos pattedyr, opnås en stor del af den regulerende “homeostatiske” funktion i højere organismer ved at opretholde et konstant indre miljø, som vores celler befinder sig i – det berømte “milieu intérieur” eller “det indre hav”, som Claude Bernard definerede . Dette opnås i vid udstrækning ved, at nyrerne koordinerer deres arbejde med hjernens registrering af plasmavolumen og -koncentration (osmolalitet) og derefter reagerer ved at øge eller reducere den mængde vand, som de afgiver i urinen. Dette vil blive diskuteret mere detaljeret nedenfor.

Ud over at opretholde cellevolumen gør en hurtig vandudveksling på tværs af cellerne det muligt for væv og organer at udskille og/eller optage vand som en del af deres fysiologiske funktion. Epithelceller, der beklæder nogle nyretubuli, er særligt velegnede til denne funktion, men celler i andre organsystemer kan også regulere transepithelial vandbevægelse for at muliggøre funktionelt vigtige processer. F.eks. involverer de væsker, der udskilles af bugspytkirtlen, galdegangen, tåre-, spyt- og mælkekirtlerne samt aksus plexus og det retinale pigmentepithel, alle hurtig transepithelial vandbevægelse.

Hvordan bevæger vand sig ind og ud af celler?

Alle disse fysiologiske processer involverer vandbevægelse gennem cellemembraner. Det har længe været kendt, at når de fleste celler anbringes i destilleret vand, svulmer de betydeligt op og kan til sidst sprænges. Når celler derimod anbringes i en saltopløsning, der er mere koncentreret end saltene og andre komponenter i deres cytoplasma, vil de skrumpe ind, når de anbringes i en saltopløsning, der er mere koncentreret end saltene og de andre komponenter i deres cytoplasma. Denne proces skyldes i vid udstrækning osmotisk vandstrømning, op eller ned ad en koncentrationsgradient, i et forsøg fra systemets side på at afbalancere den osmotiske koncentration på begge sider af cellens plasmamembran. Men hvordan bevæger vand sig præcist over cellemembranen? Ved hjælp af et særligt apparat, der kan måle hævelse og skrumpning af røde blodlegemer, en eksperimentel model, der er let at fremskaffe og manipulere, konkluderede forskerne, at vand har 2 veje gennem membraner. Da osmotisk hævelse og skrumpning blev overvåget ved forskellige temperaturer, opdagede Solomon en langsom, temperaturfølsom proces, som blev overlejret af en meget hurtigere temperaturuafhængig proces (fig. 1). Den langsomme proces afspejlede vandets diffusionspermeabilitet på tværs af plasmamembranens fedtlipid-dobbeltlag – diffusion er temperaturfølsom. Men den hurtige proces var i overensstemmelse med tilstedeværelsen af vandige porer i membranen, som tillod en hurtigere, osmotisk drevet passage af vand, der ikke involverede diffusion (fig. 1). Macey og Farmer og andre viste derefter, at forbindelsen kviksølvklorid kunne hæmme den hurtige komponent af denne proces betydeligt, hvilket tydede på tilstedeværelsen af en proteinporer – eller vandkanal – i membranen. Kviksølvklorid binder sig til sulfhydrylgrupper (cysteinrester) på proteiner og hæmmer deres funktion: i dette tilfælde vandgennemtrængelighed. Denne forskning, der fokuserede på røde blodlegemer, bekræftede således klart konceptet om, at vandporer er ansvarlige for den hurtige, temperaturuafhængige og osmotisk drevne passage af vand gennem biologiske membraner. Som vi skal se, blev disse porer senere identificeret som aquaporinerne.

Nyren regulerer vores krops vandindhold

Nyren er et bemærkelsesværdigt organ, der er bedst kendt for at “filtrere” blodet for at fjerne affaldsstoffer som urinstof og andre giftstoffer og for at producere urin. Der filtreres ca. 180 L blod hver dag, men de fleste mennesker producerer kun ca. 1,5 L urin. Den præcise mængde afhænger af, hvor meget man drikker, hvor varmt det er, og hvor meget man dyrker motion (hvilket medfører vandtab ved sved). Omkring 90 % af den filtrerede væske fjernes i de proximale områder af nyrerne, og denne værdi er ret konstant hos de fleste mennesker. De resterende 10 % (18 L) reabsorberes imidlertid i nyrernes samleledning under påvirkning af det antidiuretiske hormon, vasopressin (VP). VP frigives af den bageste hypofyse som reaktion på dehydrering (hvilket resulterer i en stigning i serumets osmotiske koncentration) eller volumetab. Det virker på epitelcellerne i nyrerne via en specifik receptor kaldet vasopressinreceptoren (V2R) for at stimulere vandreabsorptionen, hvilket afhjælper problemet og genopretter blodkoncentrationen og/eller -volumen til det normale niveau. Den mekanisme, hvormed VP forårsager denne væskeoptagelse gennem samleledningsepitelet, er nu ret godt forstået og involverer aquaporinvandkanaler.

Tudseurinblæren som model for nyren

Det er værd at tage et skridt tilbage og se på, hvordan virkningsmekanismen for VP er blevet undersøgt eksperimentelt. Selv om virkningerne af VP på nyrefunktionen havde været velkendte i nogen tid, krævede en detaljeret dissektion af dens cellulære virkning et modelsystem, der var mere tilgængeligt end nyren. Det er meget vanskeligt (men ikke umuligt) at arbejde med de enkelte nyretubuli, da de er meget små – kun ca. 40 µm i diameter. Et stort gennembrud i forskningen kom, da Bentley (og andre) opdagede, at paddens urinblære også transporterede vand som reaktion på antidiuretisk hormon . Dette er en naturlig del af deres overlevelsesproces i naturen. Når tudsen er nedsænket i vand, absorberer den vand gennem huden og producerer masser af meget fortyndet urin, som den opbevarer i en stor, ballonlignende blære. Når padden har begrænset adgang til vand i dammen og begynder at dehydrere, frigøres dens eget antidiuretisk hormon (kaldet vasotocin, en analog til VP), som får blæreepithelet til at blive gennemtrængeligt for vand. Det vand, der er lagret i blæren, sendes således tilbage til blodet for at rehydrere dyret. I det væsentlige bærer tudsen sit eget vand på flaske med sig rundt i blæren. Paddeurinblæren blev således et meget anvendt surrogat til at undersøge og forstå VP-induceret vandstrømning gennem nyrernes samleledningsepitel.

I mange år blev paddeblæren brugt til at undersøge indtræden og udligning af VP’s virkning på vandstrømningen gennem epitelceller. Der blev identificeret mange cellulære signalveje, der regulerer denne proces nedstrøms for VP-receptorinteraktionen. Et af de mest fascinerende resultater, der fremkom af de mange undersøgelser af paddeblæren, var konceptet om vandkanaler, der indsættes i disse epitelcellers plasmamembran for at øge membranens og dermed epitelets vandpermeabilitet. Når hormonerne blev fjernet, blev disse “vandkanaler” fjernet fra plasmamembranen ved internalisering i cellen (en proces, der kaldes endocytose), hvorved membranen blev genoprettet til sin uigennemtrængelige grundtilstand og forhindrede vandgennemstrømning. Denne idé blev offentliggjort af Wade, som opfandt udtrykket “shuttle-hypotese” for at beskrive vandkanalernes frem- og tilbagebevægelse til og fra celleoverfladen i analogi med NASA’s rumfærge. Men arten af disse vandkanaler forblev ukendt.

Opdagelsen af Aquaporin-vandkanaler

Trods mange forsøg på at identificere det protein, der dannede vandkanalerne, var området stort set frosset i tid i mange år. Alle målrettede forsøg på at isolere proteinet fra rensede membraner af erythrocytter fra paddeblærer og fra nyrerne havde haft begrænset succes, selv om nogle publikationer kom tæt på, og andre gav vigtige oplysninger, f.eks. oplysninger om molekylestørrelse (ca. 30 kD) . Og så skete det, at Agre-gruppen, da de undersøgte Rhesus-faktorproteiner i røde cellers membraner, bemærkede et konsekvent “forurenende” bånd på deres geler på omkring 28 kD . I stedet for at kassere denne information gravede de lidt dybere og konkluderede, at dette kunne være den meget eftertragtede vandkanal i røde celler. Den blev isoleret og oprenset, og antistoffer viste, at den også blev udtrykt i celler i nyrernes proximale tubuli og den tynde nedadgående gren af Henle – begge er konstitutivt meget permeable for vand. Kan dette være vandkanalen? Det afgørende øjeblik kom, da Agre-gruppen injicerede mRNA, der kodede for dette protein, i et in vitro-ekspressionssystem, Xenopus-oocytter. Oocytmembranen er normalt meget uigennemtrængelig for vand – æggene lægges i ferskvand og ville sprænges op, hvis membranen var gennemtrængelig! Men efter indsprøjtning af mRNA, der kodede for den formodede vandkanal, gjorde oocytter, der blev sat ned i destilleret vand, netop dette – de sprang, mens kontroloocytter forblev intakte . Agre-gruppen indså, at det mRNA, de injicerede, havde tvunget oocyterne til at producere et nyt protein, som, når det blev flyttet til oocytmembranen ved hjælp af cellulære transportmekanismer, fik membranen til at blive yderst permeabel for vand. Der fulgte en stor fejring. En række efterfølgende artikler bekræftede, at dette nye protein, kaldet CHIP28 (channel-forming integral membrane protein of 28 kD), var den første vandkanal, der blev endeligt identificeret.

The Aquaporin Family

Snart efter at CHIP28’s molekylære identitet blev kendt, fandt andre en række homologe proteiner, der dannede en ny familie. De blev kendt som aquaporiner . På det tidspunkt, hvor navnet blev brugt første gang, var der 4 kendte aquaporiner hos pattedyr – AQP1, 2, 3 og 4. Der findes nu 13 akvaporiner fra pattedyr , og hundredvis er blevet identificeret i andre organismer, herunder planter . Alle disse har de samme overordnede strukturelle træk, med en molekylvægt på ca. 30 kD i den ikke-glykosylerede form og flere forskellige glykosyleringstilstande, der resulterer i en højere molekylvægt. De har alle 6 transmembranspændende domæner; C- og N-terminalerne befinder sig begge i cytoplasmaet; de danner en funktionel tetramer i lipiddobbeltlaget, og strukturen af vandporen i proteinet er blevet opklaret ved hjælp af røntgenkrystallografi for nogle af akvaporinerne . Uventet nok er nogle aquaporiner mere vandgennemtrængelige end andre, og nogle kan transportere andre molekyler end vand. F.eks. er AQP3 permeabel for glycerol, og AQP9 er permeabel for urinstof. Desuden er nogle akvaporiner permeable for gasser såsom CO2 og NO . Feltet for akvaporinbiologi udvides således konstant, og der kommer jævnligt rapporter om nye og uventede funktioner i forskellige celler og væv.

Aquaporin 1 og 2 (den VP-følsomme vandkanal) i nyren

AQP1, vandkanalen for røde blodlegemer, er stærkt udtrykt i proximale tubuli og tynde nedadgående Henle-led, som begge er meget permeable for vand til enhver tid. Disse tubulussegmenter er involveret i reabsorptionen af 90 % af det filtrerede vand. Et andet aquaporin, AQP2, blev identificeret i de vigtigste celler i nyrernes opsamlingskanaler . Det er disse celler, der (ligesom i paddeblæren) ændrer deres vandgennemtrængelighed som reaktion på det antidiuretiske hormon VP og dermed regulerer reabsorptionen af den resterende væske – næsten 20 l om dagen. AQP2 er den VP-regulerede vandkanal. Ved tilstedeværelse af VP ophobes AQP2 på overfladen af hovedcellerne, og vandet passerer gennem epitelet drevet af en osmotisk gradient (fig. 2). Det basolaterale aspekt af disse tubuli er hypertonisk i forhold til væsken i tubulilumen, og vandet strømmer nedad langs denne gradient i tilstedeværelse af VP. Den basolaterale membran i hovedcellerne er altid vandpermeabel på grund af tilstedeværelsen af enten AQP3 eller AQP4 i forskellige dele af nyrerne . Mængden af AQP2 i den apikale membran er således den hastighedsbegrænsende faktor, der regulerer vandreabsorptionen i nyrens samlerkanal. Mange års forskning har vist, at AQP2 genbruges mellem plasmamembranen og cytoplasmatiske vesikler i hovedceller, og VP ændrer ligevægten således, at mere AQP2 akkumuleres ved celleoverfladen og mindre er inde i cellen, hvilket forklarer den øgede membranpermeabilitet (Fig. 2). Den cellebiologi, der ligger til grund for denne proces, er delvist forstået og involverer en signalkaskade, der initieres af VP-interaktion med sin receptor, aktivering af en adenylylcyklase for at øge intracellulær cAMP, aktivering af proteinkinase A og fosforylering af AQP2-proteinet. Fosforylering er den kritiske begivenhed, der forårsager membranakkumulering af AQP2, og flere laboratorier er involveret i undersøgelser, der har til formål at forstå denne proces yderligere. Den interesserede læser henvises til nylige detaljerede oversigter om denne proces.

Patofysiologi af akvaporiner

Som man kunne forvente, er akvaporiner blevet impliceret i flere sygdomme, især i nyrerne (fig. 3). Funktionsfejl eller mutationer i AQP2 eller, mere almindeligt V2R, forårsager nefrogen diabetes insipidus (NDI), hvor patienterne ikke er i stand til at koncentrere deres urin og teoretisk set kan tømme op til 18 L fortyndet urin hver dag, dvs. den mængde, der normalt reabsorberes i samlekanalen. På grund af andre kompensationsmekanismer producerer de fleste patienter med NDI mellem 5 og 10 l om dagen . De tilgængelige behandlinger kan kun delvist lindre symptomerne, og der skal arbejdes mere for at finde bedre behandlinger. Den mest almindelige årsag til NDI er hos patienter, der modtager lithiumbehandling for bipolar lidelse. Lithium forårsager en alvorlig nedregulering af AQP2-genet af årsager, der ikke er helt forstået . Selv om det er en meget effektiv behandling af bipolar lidelse, gør dette og andre bivirkninger mange patienter tilbageholdende med at indlede et forløb med lithiumbehandling. Andre AQP-relaterede lidelser, der for det meste er identificeret i knockout-dyremodeller , er en urin-koncentrationsdefekt (AQP1 mennesker er blevet identificeret), grå stær (AQP0), slagtilfælde (AQP4) og skrøbelig hud på grund af defekt hydrering (AQP3). AQP1 og AQP2 er også blevet inddraget i cellemigration og sårheling. Endelig har akvaporinerne vakt opsigt hos reklamebureauer, der f.eks. er involveret i kosmetikindustrien. Google det og se!

Future Directions

Et spændende område inden for aquaporinbiologien er fremkomsten af de såkaldte moonlighting-funktioner for disse kanalproteiner. Disse kan være relateret til deres kanalfunktion, som i tilfældet med AQP1’s gaspermeabilitet, eller uden forbindelse med kanalaktivitet, som i tilfældet med AQP2, som er involveret i nyreudvikling via dets interaktion med integriner og den ekstracellulære matrix . Fremtidige undersøgelser vil utvivlsomt identificere flere uventede egenskaber ved aquaporinerne. Der findes et stort antal akvaporiner i “lavere” arter, der ikke er pattedyr, såsom planter, mikrober og svampe. Dette åbner mulighed for at bruge disse oplysninger til at forbedre plantevækst og tilpasning ved at stimulere AQP-funktionen og til at bekæmpe mikrobielle infektioner og svampeinfektioner ved at hæmme aquaporiner. Sådanne specifikke inhibitorer er endnu ikke tilgængelige, men hvis og når de udvikles, kan de også få vigtige roller inden for medicin som akvaporiner (til behandling af forhøjet blodtryk) og måske i forbindelse med kræft (til blokering af metastase). Vi har også meget at lære om cellebiologien i forbindelse med aquaporin-trafikken. Hvordan flyttes de rundt i cellen? Hvordan interagerer de med andre proteiner? Kan alternative signalveje identificeres og udnyttes til at omgå defekt V2R-signalering i NDI? Dette arbejde er i gang og lover at afsløre cellulære hemmeligheder, der ikke kun vedrører AQP-biologi, men også andre vigtige cellulære trafikeringsbegivenheder, der er involveret i et væld af andre sygdomme hos mennesker.

Anerkendelser/afsløringserklæring

D.B. og hans kolleger i MGH Program in Membrane Biology har modtaget løbende støtte til arbejde med aquaporiner fra National Institutes of Health, for øjeblikket bevilling nummer DK096586. D.B. modtog fra Danone Research refusion af rejseudgifter og registreringsgebyr for at deltage i den videnskabelige H4H-konference.

Author Contacts

Artikel-/publikationsdetaljer

Open Access License / Drug Dosage / Disclaimer

Denne artikel er licenseret under Creative Commons Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 International License (CC BY-NC-ND). Anvendelse og distribution til kommercielle formål samt enhver distribution af ændret materiale kræver skriftlig tilladelse. Lægemiddel dosering: Forfatterne og udgiveren har gjort deres yderste for at sikre, at valg og dosering af lægemidler i denne tekst er i overensstemmelse med gældende anbefalinger og praksis på udgivelsestidspunktet. I betragtning af den igangværende forskning, ændringer i statslige bestemmelser og den konstante strøm af oplysninger om lægemiddelbehandling og lægemiddelreaktioner opfordres læseren imidlertid til at kontrollere indlægssedlen for hvert enkelt lægemiddel for eventuelle ændringer i indikationer og dosering og for tilføjede advarsler og forsigtighedsregler. Dette er især vigtigt, når det anbefalede middel er et nyt og/eller sjældent anvendt lægemiddel. Ansvarsfraskrivelse: De udtalelser, meninger og data, der er indeholdt i denne publikation, tilhører udelukkende de enkelte forfattere og bidragydere og ikke udgiverne og redaktøren/redaktørerne. At der forekommer reklamer og/eller produktreferencer i publikationen er ikke en garanti, godkendelse eller godkendelse af de produkter eller tjenester, der reklameres for, eller af deres effektivitet, kvalitet eller sikkerhed. Udgiveren og redaktøren/redaktørerne fraskriver sig ansvaret for eventuelle skader på personer eller ejendom som følge af ideer, metoder, instruktioner eller produkter, der henvises til i indholdet eller annoncerne.