Bookshelf

Mange af de enzymer, der er involveret i peptidbiogenese, er blevet identificeret

De mest almindelige trin i prekursorbehandling og de involverede enzymer er vist i figur 18-5. De involverede endoproteaser er prohormonkonvertaser 1 og 2 (PC1 og PC2), exopeptidasen er carboxypeptidase E (CPE, også kaldet CPH og enkephalin-konvertase), og det α-amidiserende enzym er peptidylglycin α-amidiserende monooxygenase (PAM). Mange trin i biosyntesen er ikke unikke for neuropeptider, f.eks. signalpeptidspaltning, disulfidbindingsdannelse, tilføjelse og efterfølgende modifikation af N-linkede og O-linkede oligosakkarider, fosforylering og sulfatering. Som vist i figur 18-3 sker mange af de posttranslationelle trin, mens de modnende neuropeptider bevæger sig ned gennem axonet mod synapsen i LDCV’er. De senere trin i neuropeptidbiosyntesen (fig. 18-5) er unikke for neuroner og endokrine celler.

Nøgleenzymer i neuropeptidbiosyntesen omfatter endoproteaser, exoproteaser og enzymer, der modificerer enderne af peptiderne. Opdagelsen og karakteriseringen af Kex2p, den endoprotease, der kløver gærpro-α-parringsfaktor for at producere fire kopier af feromonet α-parringsfaktor (fig. 18-2), var nøglen til opdagelsen af pattedyrs prohormonkonvertaser, herunder furin, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PC7/8/LPC og PACE4 . Prohormonkonvertaserne har homologi med bakterielle subtilisiner og har en Asp-His-Ser-katalytisk triade, som består af tre nøgleaminosyrer, der er involveret i katalysen (betegnet D, H og S i fig. 18-5). Proregionen for hver af dem (Fig. 18-5) skal være til stede under biosyntesen, for at proteasen kan folde sig korrekt, men skal fjernes for at give en aktiveret protease. For PC1 og furin sker fjernelsen af proregionen inden for få minutter efter biosyntesen, mens enzymet befinder sig i det endoplasmatiske reticulum, og det er højst sandsynligt en autokatalytisk begivenhed. For de andre prohormonkonvertaser sker fjernelsen af proregionen meget langsommere. Ekspression af aktiv PC2 kræver samekspression af peptidet 7B2 (Fig. 18-5), som synes at udføre en chaperonfunktion og kan også forhindre ekspression af PC2’s endoproteolytiske aktivitet, indtil PC2 er blevet deponeret i sekretoriske granula. Der er ikke identificeret noget tilsvarende chaperon/inhibitorpeptid for de andre prohormonkonvertaser.

De pattedyrendoproteaser, der tydeligst er involveret i neuropeptidbehandling, er PC1 og PC2, Ca2+-afhængige proteaser, der findes i sekretoriske granula, hvis ekspression er begrænset til neuroner og endokrine celler (fig. 18-5). Flere andre medlemmer af denne endoproteasefamilie er mere udbredt udtrykt, mens endnu andre udtrykkes på begrænsede steder, der er forskellige fra neuroner og endokrine celler. F.eks. findes furin i stort set alle celler og er primært lokaliseret til trans-Golgi-netværket; furin katalyserer spaltninger, der er vigtige for peptidfunktionen, såsom den indledende spaltning af ELH-, nervevækstfaktor- og parathyreoideahormonprækursorerne samt spaltning inden for insulinreceptorprækursoren for at producere den aktive αβ-dimerform af receptoren. Furin kan også være medvirkende til aktivering af nogle af de andre forarbejdningsenzymer, såsom PC2 og CPE.

PC1 og PC2 kløver ved udvalgte par af basiske aminosyrer i peptidprækursorer: Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys og Arg-Lys. PC1 kan også katalysere spaltninger ved de udvalgte enkelt Arg-steder, der findes i nogle forstadier, såsom prosomatostatin og procholecystokininin. PC’ernes spaltninger i LDCV’er er nøje kontrollerede og sker ofte på en meget ordentlig måde (fig. 18-6). De første spaltninger af POMC sker på mindre end 1 time (fig. 18-6, trin 1 og 2), mens andre spaltninger først sker efter flere timer (fig. 18-6, trin 6 og 7). Den endoproteolytiske spaltning af propeptider er ofte den hastighedsbegrænsende reaktion i den peptidbiosyntetiske behandling.

Mønstret af spaltninger, der katalyseres af PC1, PC2 og furin, når de udtrykkes i neuroner og endokrine celler, er meget mere selektivt end det mønster af spaltninger, der ses i reagensglasanalyser med rensede enzymer. For eksempel kan spaltningerne, selv om prohormonkonvertaser normalt spalter ved COOH-terminus af et par basiske rester i modelpeptid-substrater, i cellerne være i midten af parrene af basiske rester, som i tilfælde af POMC-spaltning (Fig. 18-6), hvor de basiske rester er adskilt og forbliver sammen med de to resulterende modne peptider . Det er sandsynligt, at Ca2+-koncentrationen og den interne pH-værdi i LDCV’er er to variabler, som neuroner og endokrine celler bruger til at regulere den endoproteolytiske aktivitet i LDCV’er.

Det kan påvises, at andre endoproteaser spiller en rolle i neuropeptidbiosyntesen. De førende kandidater er pattedyrenes homolog af gær aspartylprotease-3 (YAP-3) og N-arginin dibasisk (NRD) convertase . En yderligere drejning i peptidbiosyntesen ses i hjertet, hvor proatrial natriuretisk faktor (proANF) lagres i LDCV’er, mens moden ANF frigives fra atriale celler til cirkulationen. Behandlingen af proANF, som indebærer spaltning efter en enkelt Arg-rest i proANF, kan ikke involvere PC1 eller PC2, da der er ubetydelige mængder af disse PC’er i hjertet.

CPE er et opløseligt protein, der findes i stort set alle LDCV’er i neuroner og endokrine celler (fig. 18-5) . Det fjerner basiske rester, Lys eller Arg, fra COOH-terminalerne af peptidintermediater, der produceres af prohormonkonvertaserne. Den blev oprindeligt identificeret på grund af dens vævsfordeling og substratspecificitet sammen med dens specifikke hæmning af guanidinoethylmercaptosuccinsyre (GEMSA). CPE er et Co2+- og Zn2+-aktiveret enzym med en kort proregion, som normalt fjernes under enzymets modning; i modsætning til prohormonkonvertaserne er CPE aktiv med proregionen påsat. Carboxypeptidasefunktionen i forbindelse med peptidbehandling er normalt ikke hastighedsbegrænsende, da peptidintermediater med COOH-terminale basiske rester kun påvises i ekstremt lave koncentrationer i vævs- eller LDCV-ekstrakter. For nylig er der blevet identificeret yderligere carboxypeptidaser, navnlig CPD, en integral membranform af enzymet med 3 carboxypeptidase-domæner. Den relative betydning af CPE og disse yderligere carboxypeptidaser for neuropeptidbehandlingen in vivo er uklar. I betragtning af at spaltning ved et par basiske rester kan ske i midten af parret, er der god grund til at tro, at der vil blive fundet en aminopeptidase i LDCV’er.

PAM er et bifunktionelt enzym, der findes i næsten alle LDCV’er (fig. 18-5) . PAM virker på peptid-substrater efter endoproteolytisk spaltning og exopeptidasevirkning, når en COOH-terminal Gly-rest er eksponeret, og konverterer peptidyl-Gly til den tilsvarende peptid-NH2. Omkring halvdelen af de kendte bioaktive peptider er α-amidede, og α-amidering er generelt afgørende for den biologiske styrke. Peptidyl-Gly- og peptid-COOH-formerne er normalt inaktive ved fysiologiske koncentrationer. Det første trin af α-amidationsreaktionen udføres af peptidylglycin α-hydroxylerende mono-oxygenase (PHM), som er den NH2-terminale del af det bifunktionelle PAM-protein. PHM binder to Cu2+-atomer, der deltager i katalysen ved at gennemgå cyklusser af reduktion og oxidation. PHM bruger ascorbinsyre som reduktionsmiddel, idet et oxygenatom fra O2 inkorporeres i peptidet under hydroxyleringstrinnet. PHM ligner således enzymatisk meget dopamin β-mono-oxygenase (DBM), som omdanner dopamin til noradrenalin (se kap. 12). Det andet trin af α-amidationsreaktionen udføres af et andet enzymatisk domæne af PAM, peptidyl-α-hydroxyglycin α-amidationslyase (PAL). PAL-domænet udgør et nyt, tosidigt metalionafhængigt enzym. Neuroner udtrykker primært en integreret membranform af det bifunktionelle PAM-protein (Fig. 18-5), mens en yderligere mRNA-splejsning gør det muligt for nogle endokrine celler at udtrykke opløselige versioner af proteinet, der mangler transmembrandomænet. I de integrale membranformer af PAM strækker det korte COOH-terminale domæne sig ind i cytoplasmaet og deltager i ledningen af PAM mellem LDCV’er og celleoverfladen. Tilførslen af reduceret ascorbat i LDCV’erne opretholdes af cytokrom B561, et protein, der har fem transmembrandomæner og transporterer elektroner fra cytosolisk ascorbat til ascorbat i LDCV’ernes lumen . Cytokrom B561 findes også i catecholaminholdige vesikler, hvor det udfører en lignende funktion for DBM (se kap. 12). Nervøse og endokrine væv opretholder koncentrationer af reduceret ascorbat omkring 100 gange højere end blodkoncentrationen af ascorbat, mens de fleste andre væv ikke koncentrerer ascorbat.

Flere peptider har NH2-terminale pyroglutaminsyrerester, også kaldet cyklisk glutaminsyre (<Glu), som er essentielle for bioaktiviteten, f.eks. thyrotropin-frigivende hormon (TRH) og gonadotropin-frigivende hormon (GnRH). Det enzym, der er ansvarligt for dette trin, er glutaminylcyklase, som omdanner det oprindelige NH2-terminale Gln til <Glu. Reguleringen og funktionen af glutaminylcyklase er endnu ikke blevet udførligt undersøgt. En anden vigtig, men sjældent forekommende modifikation af peptider er α-N-acetylering (fig. 18-6 og 18-7). Under POMC-behandlingen øger α-N-acetylering i høj grad ACTH(1-13)NH2’s hudfortørrende potens, mens den ophæver både ACTH’s binyrebarksteroidogene potens og β-endorfinets opiataktivitet . Det eller de enzymer, der er ansvarlige for denne modifikation, er endnu ikke blevet oprenset eller klonet.

Som et eksempel viser Figur 18-6 mønsteret af behandlingstrin i POMC-systemet . De indledende endoproteolytiske trin (fig. 18-6, trin 1-4) formidles af PC1 og forekommer i alle POMC-producerende neuroner og endokrine celler, normalt i den viste numeriske rækkefølge. Det er klart, at trin 1 og 2 indledes i trans-Golgi-netværket og fortsætter i LDCV’erne, mens trin 4 kun forekommer i LDCV’erne. Trin 5-7 forekommer kun i LDCV’er og synes at kræve PC2. I den voksne forreste hypofyse indeholder corticotroperne PC1, men ikke PC2, og de udfører kun spaltningstrin 1-4. Under den tidlige postnatale udvikling udtrykker corticotroperne imidlertid også PC2, og spaltningstrin 5-7 ses midlertidigt i corticotroperne. Hos rotten falder ekspressionen af PC2 og spaltning inden for ACTH (spaltning 5) samtidig et par uger efter fødslen, omtrent på det tidspunkt, hvor det voksne mønster af ACTH-kontrol over binyrebarksteroidogenese fremtræder.

Melanotropes og CNS neuroner, der laver POMC, udtrykker både PC1 og PC2, og derfor ses de mindre peptidprodukter i disse celler. PAM udtrykkes i alle POMC-producerende celler, så α-amidering af joining peptid (JP), et lille peptid uden nogen klar biologisk funktion, sker hurtigt i alle POMC-celler (fig. 18-6). I melanotroperne i den intermediære hypofyse og POMC-neuronerne i kernen af solitære tractus solitalis forekommer α-N-acetylering af ACTH(1-13)NH2 og β-endorfin. I melanotroperne kan α-N-acetylering af ACTH forekomme før spaltning 5. Som angivet i figur 18-4 bestemmer de særlige spaltninger, der foretages, og de modifikationer, der foretages på NH2- og COOH-terminalerne af peptidprodukterne, hvilken blanding af bioaktive peptider, der frigives.