Abstract
Med stadig bedre separation af komplekse prøver og detektion af ukendt materiale er flydende kromatografi kombineret med massespektrometri (LC-MS) blevet anvendt i vid udstrækning i forskning i traditionel kinesisk medicin (TCM). Denne artikel beskriver principperne for væskekromatografi (LC) og massespektrometri (MS) og deres fordele og ulemper ved kvalitativ og kvantitativ analyse af TCM. Vi hentede forskningslitteratur om anvendelsen af LC-MS i TCM, der er offentliggjort i løbet af de sidste fem år i ind- og udland. For bedre at kunne vejlede analysen af TCM fokuserer denne gennemgang primært på LC-MS’ anvendelseskategori, hvor ofte forskellige former for LC-MS anvendes, og de forskellige LC-MS’ kvalitative og kvantitative evner i forbindelse med undersøgelsen af TCM.
1. Indledning
Tusindvis af års ophobning af erfaringer om liv og sygdom, som vores forfædre har gjort, er endelig blevet omsat til et moderne apotek. Kinesiske urter, med komplekse og forskellige ingredienser, sættes normalt i praksis ved recept, efter reglerne om monark, minister, assistent og guide. Når de anvendes, kan mængden af enkelte urter og farmaceutiske formuleringer variere, hvilket kan føre til ændringer i interaktionen mellem lægemidlerne og den aktive bestanddel. På forskellige lægemiddelanvendelsessteder vil der være forskelle i ingredienserne. På grund af kompleksiteten af den kemiske sammensætning af TCM kan forskellige kemiske sammensætninger også reagere med hinanden. Selv om den praktiske anvendelse har bevist TCM’s effektivitet, er det stadig vanskeligt at forklare TCM’s specifikke aktive bestanddele i moderne videnskab. I de seneste år er et stofs in vivo-metabolisme og virkningsmekanisme blevet et varmt forskningsemne inden for kinesisk medicin. Men dens karakteristika, såsom kompleks sammensætning, mekanisme af multitarget og multimode af handling og ingrediensernes rolle, giver forskningen af TCM en vis grad af vanskelighed.
LC-MS integrerer fuldt ud den høje separationskapacitet af prøven af LC til komplekse prøver og den stærke kvalitative evne af MS . På grund af dens høje følsomhed og selektivitet er LC-MS-teknikken blevet anvendt i vid udstrækning i TCM-forskningen.
2. LC
Khromatografi adskiller blandingen ved hjælp af forskellene i fordelingskoefficienten mellem de to faser (mobil og stationær fase). Efter tilstanden af den mobile fase kan kromatografi inddeles i gaskromatografi, væskekromatografi og kromatografi med superkritisk væske, mens kromatografi efter den stationære fases geometriske former kan inddeles i kolonnekromatografi, papirkromatografi og tyndtlagskromatografi. Den mest almindeligt anvendte LC-metode er kolonnekromatografi, hvor væske anvendes som mobil fase. Højtydende væskekromatografi (HPLC) er modificeret på grundlag af den klassiske flydende kolonnekromatografi.
Anvendelsen af LC er opdelt i to kategorier. En af dem er kvalitativ eller kvantitativ for en bestemt sammensætning. Kvalitering forvaltes i henhold til konsistensen mellem prøven og målkomponenten i peaktiden . Kvantificering udføres i henhold til den standardkurve, der genereres, efter at standarder er injiceret på forskellige koncentrationsniveauer. Den anden er et fingeraftryk, som henviser til den opfattelse, at efter at fingeraftryksprøven er blevet bortskaffet på en eller anden måde, kan vi opnå kromatogram eller spektrogram mærket kemiske egenskaber ved hjælp af visse analysemetoder.
LC har en stor fordel på evnen til at adskille komplekse prøver, så det er den mest effektive mulighed, når den anvendes til at adskille blandinger, men ikke egnet til at opnå strukturel information af materialet . Kvalificering afsluttet ved kontrasten mellem toppositionerne af ukendte forbindelser og standarderne er ikke tilgængelig til overvågning af ukendte forbindelser.
3. MS
Massespektrometri anvendes i vid udstrækning inden for TCM-forskningen på grund af dens høje selektivitet, høje følsomhed og evne til at give oplysninger, herunder relativ molekylmasse og strukturelle egenskaber. MS supplerer kvalificeringen ved hjælp af molekylmasse og relevante strukturelle oplysninger og supplerer kvantificeringen ved hjælp af forholdet mellem toppen og det indhold af forbindelser, som toppen repræsenterede. Ionisering ved atmosfærisk tryk (API) i MS har elektrosprayionisering (ESI) og kemisk ionisering ved atmosfærisk tryk (APCI) . For mange typer forbindelser har ESI en høj følsomhed. Sammenlignet med ESI er APCI velegnet til de mindre polære forbindelser og til analyse af flygtige forbindelser. Afhængigt af forskellene mellem de anvendte masseanalysatorer konkluderer almindelige MS quadrupolmassespektrum (Q-MS), time-of-flight-massespektrum (TOF-MS) og ionfælde-massespektrometri (IT-MS) .
Tandem-massespektrometri henviser til to eller flere MS, der arbejder sammen. Den mest almindeligt anvendte tandem-massespektrometri er triple-quadrupol-massespektrometri (QQQ-MS). For at bruge quadrupol til at udføre flertrinsmassespektrometri placeres tre quadrupoler i rækkefølge, hvilket er triple quadrupol . En anden type tandem-massespektrometri, såsom quadrupol-time-of-flight-massespektrometri (Q-TOF-MS) og quadrupol-ionfælde-tandem-massespektrometri (Q-IT-MS), består også af en række forskellige kvalitetsanalysator-serier . Ionfældens tidsserie kan opnå multistage MS-scanninger sekventielt på forskellige tidspunkter, så denne undersøgelse kategoriserede IT-MS som tandemmassespektrometer.
Tandem-massespektrometri kan inducere fragmenter af molekylære ioner, der er genereret af første fase MS, i henhold til hvilke vi kan udlede forholdet mellem barn og forælder, opnå strukturelle oplysninger om molekylet og derefter foreslå forbindelsens struktur og udføre kvalifikationsanalysen for kendte og ukendte forbindelser mere præcist.
Selv om MS kan give strukturelle oplysninger om et materiale, kræver det højere renhed for prøven. I TCM-forskning anvendes den generelt i kombination med LC.
4. LC-MS
LC-MS-teknik, der anvender LC som separationssystem og MS som detektionssystem, opnår i sidste ende spektret. Når LC og MS arbejder sammen, kan de udføre multistage MS for at spekulere på forbindelsens struktur og dermed afslutte kvalitativ og kvantitativ analyse mere præcist .
Ved at hente papirerne om LC-MS i anvendelsen af TCM-forskningslitteratur offentliggjort i løbet af de sidste fem år i ind- og udland fandt vi, at de kunne adskilles i to kategorier, dvs. LC-Q-MS og LC-MS/MS. For at analysere forskellene og fordelene og ulemperne ved hver metode blev artiklerne klassificeret i henhold til forskellen på tandemmassespektrometri.
4.1. LC-Q-MS
LC-Q-MS kan anvendes til at foretage kvalitativ og kvantitativ analyse af standardkomponenter, som vist i tabel 1. Ved kvalitativ analyse kan vi få strukturelle oplysninger ved at scanne positive eller negative ioner . Vi kan også gøre det klart, hvilken type stof den kemiske struktur tilhører ved at sammenligne den med standardlitteraturen . LC-Q-MS kvantificerer forbindelser på grundlag af udvælgelse af specifikke ioner til overvågning . I mangel af standarder kan LC-Q-MS foretage den kvalitative analyse af stoffet ved hjælp af massespektrometriens stærke kvalitative egenskaber .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
LC-Q-MS kan analysere stoffer kvalitativt, men nogle isomerer eller stoffer med identisk molekylvægt skal udforskes yderligere, hvis strukturer kræver yderligere identifikation ved henvisning til flertrinsmassespektrometri. Desuden fører en upræcis kvalitativ bestemmelse til skævhed i kvantificeringen.
4.2. LC-MS/MS
4.2.1. LC-IT-MS
IT-MS opfanger ioner af forskellig kvalitet ved hjælp af forskellige størrelser af den højfrekvensspænding, der anvendes på ringelektroderne. Det har høj følsomhed, og et enkelt IT-MS kan opnå massespektrometriske funktioner på flere niveauer.
IT-MS kan realisere tidsserier multistage MS-scanninger i forskellige kronologiske rækkefølger, hvilket giver ingrediens MSn-fragmentering; det er således egnet til kvalitative spørgsmål, hvilket giver strukturelle oplysninger til identifikation af ukendt sammensætning, som vist i tabel 2. I undersøgelsen af TCM anvendes LC-IT-MS almindeligvis i kvalitativ sammensætning .
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4.2.2. LC-QQQQ-MS
Triple quadrupol betyder, at tre quadrupoler er ordenligt placeret. Hver quadrupol har en separat funktion. Scanningstilstande for triple quadrupol omfatter fuld scanningstilstand, produktionscanningstilstand, parent-ionscanningstilstand, neutral tabscanningstilstand, udvalgt ionscanningstilstand og scanningstilstand til overvågning af flere reaktioner .
LC-QQQQ-MS anvendes hovedsagelig til kvantificering , som vist i tabel 3. Nogle undersøgelser anvendes til kvalificering . Sammenlignet med LC-Q-Q-MS kan LC-QQQQ-MS vælge bestemte ioner til kollision og analysere fragmenterne efter kollisionen. LC-QQQQ-MS kan detektere moderionen og datterionen på samme tid, så det er nøjagtigt, følsomt og omfattende. LC-QQQQ-MS kan anvendes til et bredere område. Sammenlignet med andre tandem-massespektrometrier har triple quadrupol den bedste kvantitative reproducerbarhed. LC-QQQQ-MS er den mest almindeligt kendte stofkvantitative metode.
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
4.2.3. LC-Q-TOF-MS
LC-Q-TOF-MS anvendes generelt til kvalitering. Det har højere detektionsfølsomhed og masseopløsning. LC-Q-TOF-MS kan nøjagtigt måle massen .
LC-Q-TOF-MS anvendes hovedsagelig til kvalitativ materialeanalyse , som vist i tabel 4. Sammenlignet med flere andre tandemmassespektrometrier har det fordele med hensyn til detektionsfølsomhed, massepræcision og opløsning. Høj opløsning og massepræcision giver LC-Q-TOF-MS en bedre kvalitativ evne til at analysere fragmentioner. Det er også mere overbevisende, når der skelnes mellem ioners struktur og isomerer ud over at analysere ukendte strukturer i denne metode .
|
|||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
5. Konklusioner
Sammenlignet med LC-MS og LC-MS/MS udføres forskningen af LC-MS/MS relativt mere, som har en højere nøjagtighed af kvalitativ analyse for kendte og ukendte forbindelser. LC-IT-MS har på grund af sin evne til flere niveauer af massespektrometri en bedre ydeevne ved vurdering af en ukendt sammensætningsstruktur. LC-Q-IT-MS har en bedre kvalitet af opløsning end LC-IT-MS. Sammenlignet med de tre andre former for LC-MS/MS blev det konstateret, at LC-QQQQ-MS oftere anvendes til forskning og har en bedre kvantitativ evne end de andre. Dens kvalitative evne er god, men endnu ikke så god som LC-Q-TOF-MS. LC-Q-TOF-MS anvendes hovedsagelig til kvalitativ analyse af stof. Nogle af dens evner er relativt fremragende, f.eks. følsomhed for detektion, massepræcision og opløsning.
Kvalitative metoder er forskellige blandt forskellige LC-MS-metoder, mens de kvantitative metoder grundlæggende er de samme, fordi alle kvantitative metoder kræver standard med forskellige koncentrationer. Kvantitative metoder er normalt opdelt i to forskellige typer: den eksterne standardmetode og den interne standardmetode. Ved ekstern standardmetode forstås, at der for at foretage den kvantitative analyse først genereres en standardkurve, hvis horisontale akse repræsenterer koncentrationer og vertikale akse repræsenterer farvetopspektrumsarealet. Derefter kan der foretages en kvalitativ analyse på grundlag af toparealet. Ved intern standardmetode forstås, at den interne standard med kendt koncentration først tilsættes til opløsningerne af prøven og det hybride referencestof; derefter dannes en standardkurve, hvis horisontale akse repræsenterer forholdet mellem referenceprøvens koncentration og den interne standardprøves koncentration, og hvis vertikale akse repræsenterer forholdet mellem standardtoppearealet og det interne standardtoppeareal. Til sidst injiceres den interne standardprøve. I henhold til toparealet af testindikatorer og den interne standard kan der foretages en kvalitativ analyse.
I forskningen af TCM konkluderes det, at LC-Q-TOF-MS er et bedre valg til kvalitativ analyse, mens LC-Q-QQQ-MS viser sig at være bedre til kvantitativ analyse. Kvantitativ analyse udføres ved hjælp af specifik standard med specifik koncentration. Kvalitativ analyse kan måle strukturen af nogle ukendte ingredienser og spekulere i deres tilknytning i henhold til oplysninger fra eksisterende forskningslitteratur og databaser. Standardvalidering er den mest præcise for kvalitativt materiale. På grund af TCM’s komplekse sammensætning og ukendte evner kan forskningsmetoderne relativt set ikke opfylde behovet endnu. Yderligere forskning og udforskning er stadig nødvendig.
Kompetitive interesser
Alle forfattere erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende interesser.
Akkreditering
Dette arbejde er støttet af National Natural Science Foundation of China (no. 81273925).