Kondensatoren – forskellige typer. Kontrast i mikroskopet
I den foregående artikel om okularet påpegede jeg, at okularet normalt var placeret således, at dets forreste brændflade var sammenfaldende med det primære billedplan (PIP). PIP er konjugeret med prøven i det billeddannende sæt af konjugerede planer og er således nyttigt til måling af træk ved mikroskopiske prøver.
På samme måde er kondensorens forreste brændpunktsplan konjugeret med objektivets bageste brændpunktsplan (men ikke med prøven) i belysningsstråleforløbet. Kondensoren udgør derfor et tilgængeligt sted, hvor vi kan ændre eller regulere billedets kontrast ved at manipulere de belysende lysstråler. Disse to principper udspringer af Köhlers belysningsmetode, som blev behandlet i del 3 af denne serie.
Kondensorens funktion
Kondensoren udfylder to funktioner i mikroskopet. Den tilvejebringer et område med jævnt belyst lys i synsfeltet ved prøveplanet og belyser objektivets åbning ensartet med lys af tilstrækkelig, men kontrollerbar vinkel. For det andet giver det, som nævnt ovenfor, mulighed for at regulere kontrasten (Bradbury & Evennett, 1996). Den enkleste form for kondensor er det konkave spejl, men dette er ikke nyttigt for objektiver over NA 0,2 eller deromkring. Hvis dit mikroskop har et spejl og en ekstern lyskilde, skal den flade side af spejlet anvendes sammen med en eventuel monteret substage-kondensor. Dette skyldes, at kondensoren strengt taget skal modtage parallel belysning og således bringe dette lys i fokus i kondensorens bageste brændpunktsplan (hvor prøven befinder sig).
Typer af kondensorer
Den mest udbredte kondensortype er Abbe-kondensoren til lysfeltmikroskopi (figur 1a, 1b). Den er opbygget af to eller tre linser, og den øverste linse med kort fokus kan normalt vendes ud af den optiske bane (1a) eller skrues af (1b) for at udfylde synsfeltet med objektiver med lav effekt. Denne enkle belysningsenhed vil være tilstrækkelig til de fleste typer mikroskopi. Den blev oprindeligt konstrueret til at levere smalle stråler (eller “blyanter”) af skråt lys fra en excentrisk placeret åbning i kondensorens forreste brændflade. Figur 1c viser en enkel Abbe-belysningsanordning med to linser monteret på et underbilledapparat, som kunne drejes og flyttes excentrisk for at give skrå belysning. Figur 1d viser en kondensor med lav effekt, der er konstrueret til fuldstændigt at udfylde det store synsfelt på objektiver med meget lav forstørrelse.
Og selv om der kan angives en numerisk apertur for kondensoren (ofte 0,9 NA for tørre kondensorer og højst 1,4 NA for oliedimmersionstyper), giver disse tal ingen indikation af den NA, for hvilken de belysende stråler er korrigeret for sfærisk aberration. I mange simple kondensatorer er en fast lyskegle til aksial belysning sjældent korrigeret for sfærisk aberration over 0,45 NA. For at opnå arbejde af høj kvalitet og for at kunne opløse strukturer ved opløsningsgrænsen skal kondensatorer korrigeres for aberrationer. Fuldt korrigerede kondensatorer indeholder ligesom objektiver mange linseelementer og kan korrigeres næsten i samme grad som objektiver. Den akromatisk-aplantiske kondensor (1e) er korrigeret for både sfærisk og kromatisk aberration og bør anvendes til arbejde af højeste kvalitet og til farvefotomikrografi. Aplanatiske kondensatorer er kun korrigeret for sfærisk aberration.
Såkaldte “universal”-kondensatorer (figur 2) er multifunktionelle. De består af en roterende skive med et udvalg af aperturblænder, filtre, filterblænder, patch-stop, faseplader eller Wollaston-prismer til differentiel interferenskontrast (DIC). Dette arrangement gør det nemt og bekvemt at skifte fra en kontrastmetode til en anden. Mørkegrundspærren fungerer normalt kun op til NA 0,5 eller deromkring. Til brug med objektiver med højere NA skal der anvendes en specielt konstrueret mørkegrundskondensor (figur 3). For nærmere oplysninger om brugen af denne og andre kontrastforbedringsmetoder henvises til Bradbury & Evennett (1996).
Figur 2. Universalkondensatorer. Det centrale billede viser det øverste dæksel fjernet og viser den roterende skive, hvor aperturfaseannuli, DIC-prismer, mørkegrundsplasterstop, Rheinberg-skiver og Hoffman-modulationsfiltre er placeret. De fleste universalkondensatorer er udstyret med en apertur-iris til arbejde i lysfelt, flere annuli til fasekontrast og et mørkegrundstop til mørkegrund med lav effekt.
Figur 3. Mørkegrundskondensatorer. 3(a) Tør mørkegrundskondensator. 3(b) & 3(c) Mørkegrundskondensatorer med oliedypning. 3(d) Justerbar mørkgrundskondensator med oliedypning; denne kondensator kan justeres til at passe til forskellige tykkelser af objektglas, så der opnås et mørkgrundsbillede af høj kvalitet.
Gennemlysnings- og refleksmikroskopi
Instillingen af gennemlysningsmikroskopet kræver en separat kondensator, da lyset først kondenseres på prøven (hvor lyset interagerer med stoffet) og derefter opsamles af objektivet længere fremme langs den optiske akse.
Situationen i refleksmikroskopet er anderledes. Her er strålebanen foldet om prøvens akse, hvor lyset reflekteres fra dens overflade. Objektivet fungerer som sin egen kondensator, og justeringen af reflekslysmikroskopet er meget forenklet (se strålediagrammerne i del 2 i denne serie). Det er imidlertid vanskeligt at få adgang til objektivets bageste brændpunktsplan (det forreste brændpunktsplan, når det anvendes som kondensor), så der anvendes supplerende linser for at skabe en position, hvor billedet af blænder og filtre er sammenfaldende med det bageste brændpunktsplan.
Indfaldslys-systemet er meget nyttigt til fluorescensmikroskopi, hovedsagelig fordi belysningen af prøven er enkel, fordi det er mere effektivt (giver lysere billeder ved høje forstørrelser), og fordi det er muligt at kombinere det med andre kontrastmetoder ved gennemlysning.
Figur 4. Illustration af en epi-belysningsenhed til mikroskopi med reflekteret lys
Denne epi-kondensator har to typer objektiver med reflekteret lys monteret i sit næseparti. Det anvendte objektiv er konstrueret til belysning i mørke, mens de to andre objektiver, der kan ses, er beregnet til reflekteret lysarbejde i det lyse felt. De brede kraver omkring de to sidstnævnte objektiver gør det muligt at centrere objektivet i forhold til den optiske akse. “D” på epi-illuminatorhuset angiver den udskiftelige indsats, der gør det muligt at anvende enheden til mørkfeltsbelysning. Den kan udskiftes med et plant spejl til lysfeltmikroskopi med reflekteret lys. Gennemlys-kondensoren er blevet fjernet fra undersiden af scenen.
Hvis objektivet fungerer som sin egen kondensor ved mikroskopi med reflekteret lys, hvorfor anvendes objektiver så ikke også til belysning ved mikroskopi med gennemlys? Bortset fra de praktiske vanskeligheder med at få adgang til objektivets bageste brændpunktsplan er det vanskeligt at anvende objektiver til flere funktioner, og belysningsvinklen kan normalt ikke reguleres (ved hjælp af en irisblænde i objektivets bageste brændpunktsplan).
Grundlæggende principper for kontrastforbedring
Det er nødvendigt med tilstrækkelig synlighed eller kontrast, for at vi kan opfatte detaljerne i det billede, der opløses af vores mikroskoper. Selektivitet er vigtig: Vi har brug for i det mindste nogle regionale forskelle inden for objektet og mellem objektet og baggrunden for at kunne skelne detaljer.
Kontrast i billedet fås på tre måder, enten hver for sig eller i kombination. De er:
- samspillet mellem objekt og lys,
- manipulation af belysningen og
- manipulation af billedoptagelsesmediet.
Kontrastændring i del (c) kan opnås ved hjælp af fotografisk fremkaldelse og/eller udskrivning og også ved hjælp af elektronisk kontrast af analoge video- eller digitale billeder. Kondensatoren er imidlertid medvirkende i del a) og b) til at manipulere kontrast og synlighed i billedet. Yderligere oplysninger om de teoretiske og praktiske aspekter af kontrastteknikker i lysmikroskopi kan findes i Bradbury & Evennett, 1996 og Sanderson, 2002, 2000, 1998 og 1994. Kort fortalt er de bedst kendte former for kontrastgenerering bright field, skrå belysning, dark-ground & Rheinberg, fasekontrast og DIC. Det er også muligt at kombinere disse metoder med forskellige belysningsformer (f.eks. polariseret lys med Rheinberg eller fasekontrast ved transmitteret lysfelt med indfaldende fluorescens). Da kontrastforbedring i høj grad er under mikroskopistens kontrol, kan betydningen af korrekt brug af kondensoren ikke understreges nok.
Kondensoren skal være fokuseret korrekt (se del 3, indstilling af mikroskopet til Köhler-belysning) for at opnå den bedste billedkvalitet. Dette gælder uanset hvilken metode til kontrastforbedring (bright field, fase, dark-ground) der anvendes. Den mest indlysende effekt af en de-fokuseret kondensor i lysfeltmikroskopi er et betydeligt tab af opløsningsevne, hvilket igen giver et “råddent” billede med diffraktionshaloer omkring hvert enkelt punkt i billedet. Det samme resultat opstår, hvis den øverste (kortfokuserede) linse udelades eller efterlades udadvendt, når der anvendes et objektiv med høj effekt, og objektivets bageste brændflade ikke fyldes helt med lys.
Når fasekontrastmikroskopi forsøges med en forkert fokuseret kondensor, vil kondensorens annulus ofte ikke passe til diameteren af faseringens ring i objektivets bageste brændflade, og enhver kontrastforbedring går tabt. Problemer med fokusering af kondensatoren kan også resultere i dårlig mikroskopi i mørke omgivelser, hvis billedet af pletstoppet ikke helt dækker den direkte belysning fra objektivet. Næste del i denne serie vender tilbage til objektivet og behandler rørlængden, og hvordan man bestemmer objektivets brændvidde, forstørrelse, blænde og andre parametre.
Bradbury S. & Evennett P. J. (1996) Contrast Techniques in Light Microscopy. Bios Scientific Publishers. ISBN 1-85996-085-5
Sanderson, J. B. (1994) Contrast in Light Microscopy (Kontrast i lysmikroskopi): An Overview. Proceedings of the Royal Microscopical Society 29/4:263-270
Sanderson, J. B. (1998) Contrast Enhancement Techniques for Light Microscopy in Cell Biology (Kontrastforbedringsteknikker til lysmikroskopi i cellebiologi): A Laboratory Handbook 2nd Edn. Cellis, J. (ed). (1998) Vol 3: 15-33, Academic Press. ISBN (4-binds sæt) 0-12-164725-0; kun bind 3 = 0-12-164728-5
Sanderson, J. B. (2000) The The Theory of Contrast Control in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 38:617-627.
Sanderson, J. B. (2002) Practical Control of Contrast in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 39:275-288.