H MODELOS PARA REGULAMENTO TRANSCRITCIONAL DO β-GLOBIN LOCUS
Manipulação genética do locus β-globin locus e os efeitos resultantes na transcrição, sensibilidade ao DNase, acetilação do histone, etc, levaram ao desenvolvimento de dois modelos principais para explicar como este locus complexo é regulado (para revisões, ver Bulger e Groudine, 1999; Engel e Tanimoto, 2000; Fraser e Grosveld, 1998; Orkin, 1995). Esses modelos focalizam como a LCR e suas regiões de flanco funcionam para regular expressão e abertura do locus.
O modelo de looping, ou competitivo, afirma que o elemento de deleção hispânica (contendo a LCR) funciona contactando diretamente o promotor do gene dentro do locus β-globin que deve ser expresso. Foi demonstrado que o início do transcript ocorre em apenas um promotor em qualquer momento específico em uma determinada célula (Gribnau et al., 1998). Este modelo explica que a iniciação de um único promotor é o resultado da competição dos promotores pelo contato com a LCR. Tal contacto directo exigiria obviamente o looping da cromatina interveniente, mas ainda não há provas directas para tal looping. Transgenes contendo a LCR e um único gene fetal humano (γ) ou adulto (β) globina expressaram os genes ao longo do desenvolvimento sem especificidade de desenvolvimento; entretanto, transgenes contendo a LCR e ambos os genes restauraram a expressão normal de desenvolvimento, indicando que a competição gênica é importante para a expressão devidamente regulada (Behringer et al., 1990; Enver et al., 1990). A análise dos transgenes contendo uma cópia adicional do gene e promotor β-globina suportou conclusões semelhantes. Quando a cópia adicional foi colocada perto da LCR (substituindo o gene embrionário ∊-globina), ela foi expressa 10 a 100 vezes mais eficientemente do que a cópia do gene β-globina que residia em sua localização normal bem abaixo no transgene. A transcrição da cópia extra foi detectada numa fase inicial de desenvolvimento, quando apenas os genes da globina embrionária são normalmente expressos. Quando o gene extra β-globina foi inserido logo a montante da cópia normal, a expressão das duas cópias era aproximadamente equivalente. É importante notar que o nível total de transcrição do gene transgênico β-globina permaneceu constante independentemente da posição da cópia extra, e foi aproximadamente igual à quantidade de transcrição derivada do gene endógeno β-globina (Dillon et al., 1997). A inversão do cluster do gene β-globina em relação à LCR em uma construção transgênica resultou em graves perturbações na expressão gênica. A β-globina foi expressa em todos os estágios de desenvolvimento, enquanto que o gene embrionário (∊) não foi expresso de forma alguma. A transcrição dos dois genes humanos γ-globina também foi reduzida, presumivelmente devido à competição com os genes adultos da globina para a LCR. No locus do tipo selvagem, os níveis de transcrição dos dois genes da γ-globina são diferentes. No gene transgene invertido β-globina, os níveis de expressão destes dois genes foram invertidos, indicativo de competição (Tanimoto et al., 1999). Estes resultados argumentam que a proximidade com a LCR é um determinante importante da transcrição do gene no locus β-globin.
O modelo de ligação propõe que o contato direto entre os elementos regulatórios não precisa ocorrer. A região reguladora de deleção hispânica e outros elementos cromatínicos desconhecidos são propostos para servir como plataformas de propagação de estruturas abertas de cromatina em todo o locus. A cromatina seria aberta e mantida nesta configuração por complexos de proteínas que se estendem linearmente ao longo do DNA. Tais complexos ligariam, portanto, a LCR aos promotores. Os promotores genéticos distintos serviriam então para recrutar fatores de desenvolvimento e fatores específicos do gene para a expressão gênica individual. Análises de transgenes contendo a LCR humana e genes individuais como o gene da globina embrionária (∊) e os genes da globina fetal (γ) demonstraram que a expressão correta do desenvolvimento desses genes ocorre na ausência de qualquer outro gene da globina (Dillon e Grosveld, 1991; Lloyd et al., 1992; Shih et al., 1990). Estes dados parecem estar em conflito com outros estudos (Behringer et al., 1990; Enver et al., 1990). Presumivelmente, as diferenças nas construções transgênicas e, portanto, exatamente em quais elementos regulatórios de cis-ação foram incluídos, explicam as discrepâncias. A concorrência pode ser explicada pelo modelo de ligação, por exemplo, invocando elementos de fronteira que impedem a propagação da acessibilidade. Os promotores genéticos da globina foram propostos para atuar nessa capacidade e prevenir a abertura do locus a jusante (Bulger e Groudine, 1999).
O modelo, ou uma combinação deles, poderia explicar a modulação da estrutura cromatina que está subjacente ao controle celular do rearranjo do gene receptor do antígeno. O modelo de looping fornece um mecanismo atraente para um elemento de ação cis para influenciar elementos distantes sem a necessidade de perturbar a estrutura da cromatina do DNA interveniente. Por exemplo, uma interação direta entre o intensificador intrônico IgH e um promotor VH poderia abrir seletivamente a estrutura cromatina em torno do RSS deste segmento do gene V e aproximar o RSS do segmento do gene DJ. O modelo de ligação fornece um meio atractivo através do qual alterações estruturais na cromatina podem ser propagadas a partir de um elemento para abranger todo um domínio. Por exemplo, a acessibilidade do TCRβ locus poderia começar no melhorador e mover-se a montante através dos segmentos do gene D para os segmentos do gene V, permitindo o acesso progressivo ao RSS.