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Muitas das enzimas envolvidas na biogénese do peptídeo foram identificadas

Os passos mais comuns no processamento de precursores e as enzimas envolvidas são mostrados na Figura 18-5. As endoproteases envolvidas são as prohormonas convertidas 1 e 2 (PC1 e PC2), a exopeptidase é a carboxipeptidase E (CPE, também chamada CPH e enkephalin convertase) e a enzima α-amidante é a peptidilglicina α-amidante mono-oxigenase (PAM). Muitas etapas de sua biossíntese não são exclusivas dos neuropeptídeos, tais como a clivagem do peptídeo de sinal, a formação da ligação de dissulfeto, a adição e posterior modificação de oligossacarídeos ligados a N e O, fosforilação e sulfatação. Como diagramado na Figura 18-3, muitos dos passos pós-tradução ocorrem à medida que os neuropeptídeos maduros percorrem o axônio em direção à sinapse em LDCVs. Os últimos passos na biossíntese de neuropeptídeos (Fig. 18-5) são exclusivos para neurônios e células endócrinas.

As enzimas chave na biossíntese de neuropeptídeos incluem endoproteases, exoproteases e enzimas que modificam as extremidades dos peptídeos. A descoberta e caracterização do Kex2p, a endoprotease que cliva o fator de acasalamento pro-α da levedura para produzir quatro cópias do fator de acasalamento da feromona α (Fig. 18-2), foram fundamentais para a descoberta das convertas de prohormona de mamíferos, incluindo furina, PC1/3, PC2, PC4, PC5/6, PC7/8/LPC, e PACE4 . Os conversos de prohormona partilham homologia com subtilisinas bacterianas e têm uma tríade catalítica Asp-His-Ser, que consiste em três aminoácidos-chave envolvidos na catálise (denominados D, H, e S na Fig. 18-5). A proregião de cada (Fig. 18-5) deve estar presente durante a biossíntese para que a protease seja dobrada corretamente, mas deve ser removida para produzir uma protease ativada. Para PC1 e furina, a remoção da proregião ocorre dentro de poucos minutos da biossíntese enquanto a enzima está no retículo endoplasmático e é muito provavelmente um evento autocatalítico. Para os outros convertidos prohormona, a remoção da pró-região é muito mais lenta. A expressão do PC2 ativo requer a coexpressão do peptídeo 7B2 (Fig. 18-5), que parece desempenhar uma função de chaperone e pode também impedir a expressão da atividade endoproteolítica do PC2 até que o PC2 tenha sido depositado em grânulos secretores. Nenhum peptídeo chaperone/inibidor correspondente foi identificado para as outras conversões de prohormona.

As endoproteases de mamíferos mais claramente envolvidas no processamento de neuropeptídeos são PC1 e PC2, proteases dependentes de Ca2+ encontradas nos grânulos secretores cuja expressão é limitada aos neurônios e células endócrinas (Fig. 18-5). Vários outros membros dessa família de endoproteases são mais amplamente expressos, enquanto outros ainda são expressos em locais restritos, distintos dos neurônios e células endócrinas. Por exemplo, a furina é encontrada em praticamente todas as células e está localizada principalmente na rede trans-Golgi; a furina catalisa clivagens importantes na função peptídeo, como a clivagem inicial do ELH, fator de crescimento nervoso e precursores do hormônio paratiróide, assim como a clivagem dentro do precursor do receptor de insulina para produzir a forma ativa αβ dimerizada do receptor. A furina também pode ser instrumental na ativação de algumas das outras enzimas de processamento, como PC2 e CPE.

PC1 e PC2 clivam em pares selecionados de aminoácidos básicos nos precursores do peptídeo: Lys-Arg, Arg-Arg, Lys-Lys e Arg-Lys. PC1 também pode catalisar clivagens nos locais selecionados de Arg simples presentes em alguns precursores, como prosomatostatina e procholecistoquinina. As clivagens em LDCVs pelos PCs são rigorosamente controladas, ocorrendo frequentemente de forma muito ordenada (Fig. 18-6). As clivagens iniciais de POMC ocorrem em menos de 1 hora (Fig. 18-6, passos 1 e 2), enquanto outras clivagens ocorrem somente após várias horas (Fig. 18-6, passos 6 e 7). A clivagem endoproteolítica dos propeptídeos é freqüentemente a reação limitadora da taxa no processamento biossintético do peptídeo.

O padrão de clivagens catalisadas por PC1, PC2 e furina quando expressas em neurônios e células endócrinas é muito mais seletivo do que o padrão de clivagens visto em ensaios de tubos de ensaio com enzimas purificadas. Por exemplo, embora as clivagens de pró-hormônio geralmente se clivem no termo COOH de um par de resíduos básicos em substratos de peptídeo modelo, em células as clivagens podem estar no meio dos pares de resíduos básicos, como no caso da clivagem POMC (Fig. 18-6), onde os resíduos básicos são separados e permanecem com os dois peptídeos maduros resultantes. É provável que a concentração de Ca2+ e o pH interno dos LDCVs sejam duas variáveis utilizadas pelos neurônios e células endócrinas para regular a atividade endoproteolítica nos LDCVs.

Doenças endócrinas adicionais podem desempenhar um papel na biossíntese de neuropeptídeos. Os principais candidatos são o homólogo mamífero da protease-3 (YAP-3) e a N-arginina dibásica (NRD) convertase. Uma torção adicional na biossíntese peptídeo é observada no coração, onde o fator natriurético proatrial (proANF) é armazenado em LDCVs e ainda assim a ANF madura é liberada das células atriais para a circulação. O processamento de proANF, que envolve clivagem após um único resíduo de Arg em proANF, não pode envolver PC1 ou PC2, uma vez que há quantidades insignificantes desses PCs no coração.

CPE é uma proteína solúvel encontrada em praticamente todos os LDCVs em neurônios e células endócrinas (Fig. 18-5) . Ela remove resíduos básicos, Lys ou Arg, do terminal COOH de intermediários peptídeos produzidos pelos conversos de prohormona. Foi identificada originalmente por sua distribuição tecidual e especificidade do substrato, junto com sua inibição específica pelo ácido guanidinoetlmercaptosuccínico (GEMSA). O CPE é uma enzima ativada por Co2+- e Zn2+ com uma pequena proregião que é normalmente removida durante a maturação da enzima; ao contrário dos conversos de prohormona, o CPE é ativo com a proregião ligada. A função carboxipeptidase do processamento de peptídeos não é normalmente limitada, uma vez que os intermediários peptídeos com resíduos básicos terminais COOH são detectados apenas em concentrações extremamente baixas nos tecidos ou extratos de LDCV. Recentemente, foram identificadas carboxipeptidases adicionais, notadamente CPD, uma forma de membrana integral da enzima com 3 domínios de carboxipeptidase. A importância relativa do CPE e destas carboxipeptidases adicionais para o processamento de neuropeptídeos in vivo não é clara. Dado que a clivagem em um par de resíduos básicos pode estar no meio do par, há uma boa razão para pensar que uma aminopeptidase será encontrada em LDCVs.

PAM é uma enzima bifuncional encontrada em quase todos os LDCVs (Fig. 18-5) . O PAM atua sobre substratos peptídeos após a clivagem endoproteolítica e ação da exopeptidase, quando um resíduo terminal COOH é exposto, e converte o peptídeo-Gly no peptídeo-NH2 correspondente. Cerca de metade dos peptídeos bioativos conhecidos são α-amidados, e α-amidação é geralmente crucial para a potência biológica. As formas peptídeo-Gly e peptídeo-COOH são geralmente inativas em concentrações fisiológicas. O primeiro passo da reação de amidação α-amidação é realizada pela peptidilglicina α-hydroxylating mono-oxygenase (PHM), que é a porção terminal NH2 da proteína PAM bifuncional. A PHM liga dois átomos Cu2+ que participam da catálise, submetendo-se a ciclos de redução e oxidação. A PHM utiliza ácido ascórbico como redutor, com um átomo de oxigênio de O2 incorporado ao peptídeo durante a etapa de hidroxilação. Assim, a PHM é enzimaticamente muito semelhante à dopamina β-mono-oxigenase (DBM), que converte a dopamina em norepinefrina (ver cap. 12). A segunda etapa da reacção de amidação α é realizada por um segundo domínio enzimático de PAM, peptidilα-hydroxyglycine α-amidating lyase (PAL). O domínio PAL constitui uma enzima nova, divalente e dependente de íons metálicos. Os neurônios expressam principalmente uma forma de membrana integral da proteína PAM bifuncional (Fig. 18-5), enquanto um evento adicional de emenda de mRNA permite que algumas células endócrinas expressem versões solúveis da proteína, sem o domínio transmembrana. Nas formas de membrana integral do PAM, o domínio terminal curto do COOH estende-se ao citoplasma e participa do encaminhamento do PAM entre os LDCVs e a superfície celular. O fornecimento de ascorbato reduzido em LDCVs é mantido pelo citocromo B561, uma proteína que possui cinco domínios transmembranosos e lançam electrões de ascorbato citosólico para ascorbato no lúmen dos LDCVs . O citocromo B561 também é encontrado em vesículas contendo catecolaminas, onde desempenha uma função similar para a DBM (ver cap. 12). Os tecidos nervosos e endócrinos mantêm concentrações de ascorbato reduzidas cerca de 100 vezes acima da concentração de ascorbato no sangue, enquanto a maioria dos outros tecidos não concentram o ascorbato.

Peptídeos siderais possuem resíduos de ácido piroglutâmico terminal NH2, também denominado ácido glutâmico cíclico (<Glu), que são essenciais à bioatividade, por exemplo, o hormônio liberador de tirotropina (TRH) e o hormônio liberador de gonadotropina (GnRH). A enzima responsável por esta etapa é a glutaminil ciclase, que converte o Gln terminal NH2 original em <Glu. A regulação e função da glutaminil ciclase ainda não foi extensivamente estudada. Outra modificação importante mas pouco freqüente dos peptídeos é α-N-acetylation (Figs. 18-6 e 18-7). Durante o processamento de POMC, α-N-acetilação aumenta muito a potência de escurecimento da pele do ACTH(1-13)NH2, abolindo tanto a potência esteroidogênica adrenal do ACTH quanto a atividade opiácea do β-endorfina . A(s) enzima(s) responsável(is) por esta modificação ainda não foi(m) purificada(s) ou clonada(s).

Como exemplo, a Figura 18-6 mostra o padrão de etapas de processamento no sistema POMC . Os passos iniciais do endoproteolítico (Fig. 18-6, passos 1-4) são mediados pelo PC1 e ocorrem em todos os neurônios produtores de POMC e células endócrinas, geralmente na ordem numérica mostrada. É claro que os passos 1 e 2 são iniciados na rede trans-Golgi e continuam nos LDCVs, enquanto o passo 4 ocorre apenas nos LDCVs. Os passos 5-7 ocorrem apenas em LDCVs e parecem requerer o PC2. Na pituitária anterior adulta, os corticotropos contêm PC1 mas não PC2 e realizam apenas clivagens 1-4. Entretanto, durante o desenvolvimento pós-natal precoce, os corticotropos também expressam PC2 e as clivagens 5-7 são transitoriamente observadas nos corticotropos. No rato, a expressão de PC2 e clivagem dentro do ACTH (clivagem 5) declina simultaneamente algumas semanas após o nascimento, aproximadamente no momento em que o padrão adulto de controle do ACTH sobre a esteroidogênese adrenal aparece.

Melanotropes e neurônios do SNC fazendo com que o POMC expresse tanto PC1 quanto PC2 e, assim, os produtos peptídeos menores são vistos nestas células. O PAM é expresso em todas as células produtoras de POMC, de modo que a alteração α-amidação da união do peptídeo (JP), um pequeno peptídeo sem função biológica clara, ocorre rapidamente em todas as células de POMC (Fig. 18-6). Nos melanotropos da hipófise intermediária e nos neurônios POMC do núcleo do trato solitário, α-N-acetilação de ACTH(1-13)NH2 e β-endorfina ocorre. Em melanotropos, α-N-acetilação do ACTH pode ocorrer antes da clivagem 5. Como indicado na Figura 18-4, as clivagens particulares feitas e as modificações feitas nos termini NH2- e COOH dos produtos peptídeos determinam a mistura de peptídeos bioativos liberados.