BIOPROCESS ENGINEERING
Avaliação da diversidade microbiana das bactérias desnitrificantes em reactor descontínuo
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S. I. MaintinguerI,*; I. K. SakamotoII; M. A. T. AdornoII; M. B. A. VarescheII,*
ABSTRACT
As comunidades microbianas em uma planta de lodo ativado industrial podem contribuir para o processo de desnitrificação, mas a informação sobre os microorganismos presentes nos reatores desnitrificantes ainda é escassa. A remoção de compostos inorgânicos de nitrogênio pode ser realizada pela adição de fontes de carbono ao processo biológico de desnitrificação. O etanol é uma alternativa economicamente viável como fonte de carbono em países tropicais como o Brasil, com produção em larga escala a partir da cana-de-açúcar. Este trabalho relata a aplicação bem sucedida de lodo ativado com nitrato e etanol em um reator anaeróbico em batelada. A operação durou 61,5 h com consumo total de nitrato em 42,5 h, geração de nitrito (2,0 mg/L) e consumo de etanol (830,0 mg/L) em 23,5 h. A contagem de células desnitrificadoras pelo número mais provável no início da operação foi inferior à do final, confirmando a capacidade do inóculo de lodo ativado para o processo de desnitrificação. As amostras das contagens de células foram identificadas como Acidovorax sp., Acinetobacter sp., Comamonas sp. e bactérias não cultivadas. Portanto, estas espécies podem estar envolvidas na redução de nitratos e no consumo de etanol no reator de lote.
Keywords: Sistema de lodo ativado; Acidovorax; Acinetobacter; Nitrato; Etanol.
INTRODUÇÃO
Microorganismos capazes de desnitrificação estão amplamente distribuídos na natureza: solo, sedimentos, água doce, mar e sistemas de tratamento de águas residuais (Parque & Yoo, 2009).
Muitos inóculos de estações de tratamento de esgotos domésticos e industriais podem conter bactérias desnitrificantes, principalmente em sistemas de lodos ativados (Liu et al., 2006; Daniel et al., 2009), onde a remoção biológica de nitrogênio ocorre para promover a desnitrificação, ou seja, sob condições anóxicas heterotróficas, as fontes de carbono orgânico atuam como doadoras de elétrons e reduzem o nitrato a gás nitrogênio (Canto et al., 2008). A presença de fontes orgânicas de carbono e energia é necessária para a desnitrificação heterotrófica (Nava et al., 2010).
A maior parte das bactérias desnitrificantes estão englobadas no Proteobacteria Filo, incluindo Acidovorax, Comamonas e Acinetobacter, entre outras. Tais bactérias podem estar presentes no tratamento de resíduos, especialmente em sistemas de lodo ativado, que são capazes de formar nitrogênio molecular a partir de nitrato e uma fonte exógena de carbono, como o etanol. A desnitrificação completa, ou seja, do nitrato ao gás nitrogênio é mediada por espécies de bactérias que normalmente utilizam oxigênio do ar como fonte de energia (respiração aeróbica), mas também têm a capacidade de utilizar nitrato e nitrito ao invés de oxigênio (condição anóxica). Assim, estas bactérias podem crescer aerobicamente na ausência de nitrato, ou sob condições anóxicas na presença de nitrato. A conversão do nitrato em nitrogênio molecular também é conhecida como respiração anóxica (Park & Yoo, 2009).
Tem sido utilizada uma grande variedade de compostos orgânicos, tais como metanol, etanol, glucose, acetato, aspartato ou ácido fórmico e compostos aromáticos (Queiroz et al., 2011). No entanto, a maioria das pesquisas publicadas sobre desnitrificação da água potável envolve o uso de metanol, etanol e ácido acético (Park & Yoo, 2009). Etanol (Daniel et al., 2009), glicose e acetato são alguns dos doadores externos de elétrons utilizados com sucesso para a desnitrificação. Particularmente no Brasil, o etanol representa uma alternativa viável (Gavazza dos Santos et al., 2004). O etanol é produzido em larga escala no Brasil desde 1975, com o Programa Nacional do Álcool (19751985). O Brasil produz cerca de 2,6 x 108 toneladas de cana-de-açúcar, que é processada por 324 usinas para produzir açúcar e etanol (Borrero et al., 2003). Ela é produzida em abundância a partir da cana-de-açúcar e geralmente custa menos do que outras fontes convenientes de carbono. Entretanto, a necessidade de fontes doadoras de elétrons adicionais para processos exógenos aumenta os custos operacionais, possivelmente representando uma desvantagem para o uso de tecnologias inovadoras baseadas em processos anaeróbicos (Gavazza dos Santos et al.., 2004).
As relações estequiométricas descrevendo a reação de energia bacteriana (Park & Yoo, 2009) é escrito como segue, quando o etanol é usado como fonte de carbono:
0,69 C2H5OH + NO3 + H+ → 0.14 C5H7NO2 +0,43 N2 + 0,67 CO2 + 2,07 H2O
Embora esta equação revele a quantidade estequiométrica de etanol necessária para a dissimilação de nitrato, é necessário etanol adicional para a desoxigenação e síntese celular. Na prática, 25% a 30% do etanol necessário é utilizado para a síntese celular bacteriana. Quando o oxigênio dissolvido está presente, a necessidade de etanol é correspondentemente maior. Portanto, um valor de trabalho comum da relação de peso do substrato em relação ao nitrato (C:N03) é quase 3 (Park & Yoo, 2009).
Existem apenas algumas referências sobre os reatores em batelada e o processo de desnitrificação. Estas configurações podem ser utilizadas para investigar as necessidades nutricionais (Maintinguer et al., 2008). O processo de desnitrificação com carboidratos complexos está sendo avaliado em reatores gravimétricos porque a matéria orgânica particulada presente nestes sistemas pode dificultar a operação em outras configurações, como com amido (Iamamoto, 2006). Além disso, a biomassa permanece retida no reator de batelada em todos os períodos de operação quando comparada com os reatores de fluxo contínuo. Estes fatos podem contribuir para o consumo total de nitrato verificado em reator gravimétrico (Etchebehere et al., 2001; Gavazza dos Santos et al., 2004).
A remoção de nitrato com inóculo de lodo ativado tem sido estudada particularmente em países de clima temperado. Há poucos relatos de estudos sobre remoção de nitratos e biologia molecular com inóculo de lama ativada de países tropicais como o Brasil. Neste sentido, o primeiro objectivo do nosso estudo foi avaliar o processo de desnitrificação com lodo activado como inóculo de climas tropicais. O segundo objetivo do nosso estudo foi realizar uma caracterização microbiana do inóculo com o objetivo de identificar os potenciais organismos especificamente envolvidos no processo de desnitrificação.
Este trabalho estudou a diversidade microbiana da desnitrificação em um reator descontínuo alimentado com etanol e nitrato utilizando técnicas de biologia molecular e metodologia tradicional de microbiologia.
MATERIAL E MÉTODOS
Reator Loteado
O experimento foi realizado com lodo do sistema de lodo ativado da Estação de Tratamento de Esgotos da Volkswagen São Carlos (São Carlos SP – Brasil).
Os reactores descontínuos foram preparados em triplicado em frascos Duran® de 2 L, onde 1 L foi meio de reacção, 10% (v/v) de inóculo (100 mL/L).
Os reactores foram submetidos a uma atmosfera N2 (99,99%) durante 20 min. após a distribuição das soluções. Em seguida, foram tampados com rolhas de borracha butílica, embalados e mantidos a 25 ºC ± 1 ºC, com agitação a 120 rpm operados durante 61,5 h.
Análise Físico-Química e Cromatográfica
Os sólidos voláteis totais (TVS) e o consumo de nitrato foram determinados segundo a APHA, 2005, espectrofotometricamente. A análise dos nitritos foi realizada por injeção de fluxo (FIA APHA, 2005). Os ácidos graxos voláteis e álcoois foram determinados por cromatografia gasosa em um Shimadzu GC-2010, equipado com um detector de ionização de chama, auto-amplificador para headspace COMBI-PAL – AOC modelo 5000 e coluna HP-INNOWAX (30 m x 0,25 mm x 0,25 mm de espessura do filme), de acordo com Maintinguer et al, 2008).
Quantificação de bactérias desnitrificantes
O número mais provável (NMP) de bactérias desnitrificantes foi realizado em cinco vezes a diluição no início e no final da operação do reactor descontínuo, segundo Tiedje (1982), adaptado para amostras líquidas. A contagem de células pelo método NMP foi feita após 15 dias de incubação, de acordo com APHA, 2005. A composição do meio de cultura e as concentrações de nitrato e etanol utilizadas nos ensaios MPN foram semelhantes às do reator batch, conforme mencionado anteriormente.
Biologia molecular
As amostras para análise do rRNA 16S foram obtidas a partir das maiores contagens positivas de diluição (MPN) de bactérias desnitrificantes ao final do ensaio dos reatores batch.
O ADN genómico total das amostras foi adquirido após lise celular com contas de vidro (Sigma) e extracção de fenol-clorofórmio como descrito anteriormente por Griffiths et al. (2000) modificado.
A amplificação pela reação em cadeia da polimerase (PCR) foi realizada com um primer de domínio bacteriano definido para o gene 16S rRNA, 27 para frente (5′-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3′) e 1100 para trás (5′-AGGGTTGCGCTCGTTG-3′) (Lane, 1991). A amplificação PCR (Thermo cycler Eppendorf AG – Hamburg 22.331) foi realizada com desnaturação inicial a 94 ºC durante 5 min, seguida de 30 ciclos de desnaturação a 94 ºC durante 45 s, recozimento a 55 ºC durante 45 s, extensão a 72 ºC durante 1,45 min e extensão final a 72 ºC durante 7 min e arrefecimento a 4 ºC.
Amostras de produtos PCR (Polymerase Chain Reaction) (16S rRNA) foram clonados no pGEM (Promega Easy Vector System I) do vector plasmídeo, de acordo com as especificações do fabricante. Os clones foram selecionados aleatoriamente e amplificados por PCR. O sequenciamento de nucleotídeos foi realizado em um sequenciador automatizado ABI 310 PRISM (Dye terminator Cycle Sequencing Kit, Applied Biosystems, USA) de acordo com as instruções do fabricante, utilizando um primer forward M13 (50-GTAAAA CGA CGG CCA G-30) (Messing, 1983). A amplificação PCR (Thermo cycler Eppendorf AG Hamburg 22, 331) foi realizada com desnaturação inicial a 94 ºC durante 2 min, seguida por 25 ciclos de desnaturação a 94 ºC durante 1 min, recozimento a 55 ºC durante 1 min, extensão a 72 ºC durante 1 min; e extensão final a 72 ºC durante 7 min e resfriamento a 4 ºC.
As sequências nucleotídicas foram processadas e foram alinhadas com o programa Seqman (pacote Lasergene DNAstar) para remover os sinais das bases vectoriais e de baixa qualidade. As seqüências alinhadas foram determinadas pelo programa de busca BLAST no site do NCBI comparado com as seqüências do gene 16S rRNA representadas na base de dados Genbank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) e Ribosomal Data Base Project (http://rdp.cme.smu.edu). A árvore filogenética foi construída pelo método Neighbor-Joining (Saitou & Nei, 1987) usando o programa MEGA versão 4.1 (Kumar et al., 2008). A análise de reamostragem Bootstrap para 1000 réplicas foi realizada para estimar a confiança das topologias de árvores. As seqüências conhecidas de Aspergillus niger (FJ828924.1) foram adicionadas e foi utilizado como out-group.
RESULTA E DISCUSSÃO
O nitrato foi completamente consumido após 42,5 h de operação (Figura 1). A geração de nitritos foi reduzida (2,0 mg/L às 18,5 h) e ocorreu nas 23,5 horas seguintes à operação. Foi observado 1,06 g de etanol/L (36% de consumo) após 13,5 h de operação para concentração inicial de 1.650 mg/L. O consumo de etanol ao final do experimento foi de 54% (0,77 g/L em 61,5 h). Esses resultados foram praticamente os de Gusmão et al. (2006). Os autores (op.cit.) observaram 98,9% do consumo de nitrato em 14 h de operação, com células purificadas de lodo granular de uma manta de lodo anaeróbico de fluxo ascendente (UASB) tratando águas residuais de um abatedouro de aves (DAKAR-Tietê SP Brasil), com nitrato (350 N-NO3 mg/L), etanol (377 mg/L) e benzeno (10 mg/L) como fontes de carbono.
Metanol (197,78 mg/L) e n-butanol (23,50 mg/L) foram detectados no início do experimento. Estes álcoois (metanol e n-butanol) estavam possivelmente presentes no inóculo. A concentração dos álcoois mostrou pouca variação até o final do teste, indicando que eles não foram consumidos nesta condição desnitrificante (Figura 2).
A geração máxima de ácido acético foi de 16,7 mg/L a 61,5 h de operação. Os valores de STV no início e no final do funcionamento do reactor descontínuo foram de 5,14 g/L e 11,40 g/L, respectivamente, o que indica um aumento de 122% na biomassa. Estes resultados mostraram que as condições operacionais impostas ao reactor descontínuo beneficiaram o desenvolvimento e permanência do consórcio bacteriano em condições de desnitrificação.
Neste estudo foi observado o processo de desnitrificação, como também foi descrito por outros autores utilizando configurações diferentes para os reactores.
Callado & Reatores anaeróbios Foresti (2001) operados com substrato sintético simulando esgoto doméstico para remover a maior fração de matéria carbônica e promover a nitrificação, desnitrificação e remoção biológica de fosfato do substrato no mesmo ciclo descontínuo, em um reator anaeróbio/aeróbio/anaeróbio descontínuo seqüencial. O sistema foi operado durante 41 dias com 84 ciclos de 12 horas, à temperatura de 28±1 ºC. Os autores (op.cit) observaram que a desnitrificação ocorreu em condições aeróbias e anóxicas alternadas na fase de reação. Ambos os processos ocorreram somente quando o acetato de sódio (500 mg/L) foi adicionado no início da fase anóxica.
Etchebehere et al. (2001), acetato testado (40 mmol/L) e glucose (13 mmol/L) como fontes de carbono para desnitrificação num reactor anaeróbico descontínuo com nitrato de potássio (20mmol/L) para três inóculos diferentes: lodo de um reactor anóxico (escala laboratorial) para remover carbono e azoto do lixiviado de um aterro sanitário; lodo de um reactor metanogénico UASB que trata malte e lodo de um reactor anóxico alimentado com acetato e nitrato. O nitrato foi completamente consumido a partir das três amostras de lodo testadas, conforme observado no presente estudo. Os autores (op. cit.) concluíram que o acetato é uma melhor fonte de carbono do que a glicose.
Gavazza dos Santos et al. (2004) estudaram o processo de desnitrificação realizado em reatores gravimétricos alimentados com efluentes sintéticos simulando efluentes nitrificados de estações de tratamento de esgoto doméstico, utilizando três fontes doadoras de elétrons: metanol (53,3 mg/L), etanol (38,3 mg/L) e metano (além das águas residuais sintéticas). Os autores (op.cit.) observaram que o doador de elétrons mais efetivo foi o etanol, que removeu completamente nitrito e nitrato, conforme observado neste trabalho.
Iamamoto (2006) obteve remoção de nitrogênio maior que 84% em um reator sequencial alimentado com amido e amônio alternando condições anóxicas e aeróbicas (ciclos 2h/2h) e 2 mg O2/L para as seguintes concentrações: 125 mg de N-NH4/L e 0,95 g de amido/L, 250 mg de N-NH4/L e 1,9 g de amido/L, 500 mg de N-NH4/L e 3.8 g de amido/L, com inóculo de um sistema de lodo ativado de uma Estação de Tratamento de Esgotos (Flores da Cunha Rio Claro SP Brasil). O etanol (1.500 mg/L) também foi testado como fonte de carbono juntamente com 500 mg de NH4-N/L. Os autores (op.cit.) observaram que a remoção de nitritos e nitratos foi completa (100%), como observado no presente estudo, demonstrando a viabilidade do uso de etanol no processo de desnitrificação.
As contagens de células desnitrificadoras por MPN no início da operação do reator gravimétrico foram menores (1,1 x 1010 MPN/mL) do que no final da operação (1,2 x 1019 MPN/mL) (Figura 3). Estes resultados são superiores aos relatados na literatura, descritos abaixo.
Etchebehere et al. (2001) enumeraram células desnitrificantes pelo número mais provável (NMP) em meio basal suplementado com extrato de levedura (0,5 g/L), acetato de potássio (1,84 g/L) e nitrato de potássio (0,72 g/L) e obtiveram 9,6 x 106 NMP/mL com lodo do reator anóxico de um sistema de tratamento de lixiviado. Callado e Foresti (2001) utilizaram acetato de sódio como fonte de carbono num reactor sequencial anaeróbio/ aeróbio/anaeróbio descontínuo e encontraram mais bactérias desnitrificantes MPN no início da operação (2,5 x 106 MPN/mL) do que no final (3,5 x 105 MPN/mL). Os autores (op.cit.) concluíram que esta diminuição não afetou o processo de desnitrificação.
Iamamoto (2006) obteve a mesma ordem de grandeza no NMP das bactérias desnitrificantes ao final da operação de um reator sequencial com 250 mg N-NO3/L (3,9 x 106 MPN/mL) e 500 mg N-NO3/L (1.1 x 106 MPN/mL), ambos com adição de amido (1.900 mg/L) como fonte de carbono e inóculo de lodo ativado de uma estação de tratamento de efluentes (Rio Claro SP – Brasil).
As bactérias desnitrificantes foram favorecidas pela condição nutricional imposta no reator anóxico. Este fato confirmou a capacidade do inóculo do lodo ativado para o processo de desnitrificação.
Clones 50 foram obtidos da amostra analisada para clonagem e seqüenciamento dos fragmentos do gene 16S rRNA do consórcio microbiano. Entretanto, clones com valores inferiores a 180 nucleotídeos não foram incorporados à análise filogenética porque não foram suficientes para serem comparados com a base de dados descrita abaixo. As sequências de clonagem e sequenciação foram obtidas a partir da amostra positiva de maior diluição MPN (10-18) (Tabela 1).
Acinetobacter sp. foi identificada com as semelhanças de: 98% (clones 1, 8, 13, 15, 33, 43, 45, 52, 54, 62, 67, 83 e 2, 4, 18, 20, 23 e 27) e 99% (clones 6, 15, 16, 37 e 38). É uma bactéria Gram-negativa, não-motriz, oxidase-negativa, não-fermentativa, em pares e pertence à Família Proteobacteria Filo, Moraxellaceae. É um microorganismo importante no solo, onde pode contribuir para a mineralização, por exemplo, dos compostos aromáticos (Geng et al., 2006). Wang et al. (2007) isolaram cepas de Acinetobacter em uma amostra de um sistema de lodo ativado (Jizhuangzi Tianjin – China). Esta linhagem foi capaz de biodegradar o fenol (1,1 g/L) por células livres e imobilizadas. Geng et al. (2006) isolaram bactérias degradantes do fenol em uma amostra de um Sistema de Tratamento de Lamas Ativadas (Singapura). Testes bioquímicos mostraram que esses microorganismos podem crescer na presença de etanol, glicose, sacarose e compostos aromáticos como tolueno, fenol e benzoato. Foi descrita como uma nova espécie, Acinetobacter EDP3. Os autores (op.cit.) concluíram que esta espécie pode ser utilizada para remoção de compostos fenólicos ou para biorremediação in situ do fenol nos solos. Cai et al. (2009) identificaram 58 bactérias resistentes de solos contaminados por arsênico. As cepas Acinetobacter, Agrobacterium, Arthrobacter, Comamonas, Rhodococcus, Pseudomonas e Stenotrophomonas foram identificadas em altas concentrações (20 mM Ar/L). O Acinetobacter sp. identificado neste trabalho teve seu crescimento devido às condições operacionais impostas e poderia contribuir para a desnitrificação.
Clones 24 e 26 foram semelhantes a Comamonas sp. com semelhanças de 98% e 97%, respectivamente. As Comamonas são bactérias Gram-negativas pertencentes a Proteobacteria Phylum, família das Comamonadaceae. Etchebehere et al. (2001) isolaram bactérias desnitrificantes Gram-negativas de um reator anóxico usado para tratamento de lixiviados em aterros sanitários em Montevidéu (Uruguai). As espécies isoladas tiveram similaridade com Comamonas terrigena. Entretanto, este microorganismo foi considerado uma nova espécie, chamada Comamonas nitrativorans. Foi descrito como uma bactéria gram-negativa, flagelo polar móvel, aeróbica e quimio-organotrófica. Esta espécie cresceu em etanol, acetato e butirato, nitrato, nitrito e pode reduzir o nitrato para N2,
Por isso, as espécies Comamonas identificadas neste estudo estavam presentes no inóculo do lodo ativado e poderiam contribuir para a desnitrificação que ocorreu nos testes.
Os clones 25, 28, 34, 36, 42 e 65 foram semelhantes ao Acidovorax sp. com semelhanças de 99% e 97%, respectivamente (Tabela 1). Acidovorax sp. pertence ao Proteobacteria Phylum; é facilmente encontrado em sistemas de lodo ativado. Muitas espécies de Acidovorax actuam como microrganismos reguladores dos processos de tratamento microbiológico em sistemas de lamas activadas. Várias espécies de Acidovorax são utilizadas na biodegradação de plásticos e na remoção de outros contaminantes orgânicos, incluindo nitrofenóis, nitrobenzeno e bifenilos policlorados através da desnitrificação (www.cebl.autokland.ac.nz/ecogenomics/index.html). Khan et al. (2002) isolaram espécies de bactérias desnitrificantes degradantes PHBV (poli-3-hidroxi-butyrate-co-3-hidroxivalerato) de três sistemas de lodos ativados, usados no tratamento de esgotos municipais (Nagoya, Osaka, e Toyohashi – Japão). Os 37 clones analisados mostraram similaridade com organismos pertencentes à classe Betaproteobactérias. A maioria dos clones mostrou similaridade com a espécie Acidovorax, confirmando que esta espécie estava envolvida na degradação do PHBV sob condições desnitrificantes. Gentile et al. (2007) isolaram espécies similares a Acidovorax, Delftia acidovorans, Pseudomonas, Chryseobacterium e Achromobacter de um reator desnitrificante operado com etanol (40,0 g/L) e ácido lático (40,0 g/L) como fontes de carbono; eles testaram doadores de elétrons separadamente e o nitrato (1,9 g NaNO3/L; 2,3 g KNO3/L) foi usado como fonte de nitrogênio. Os autores (op. cit.) concluíram que a redução completa do nitrato para N2 foi feita pelas espécies Acidovorax, enquanto Achromobacter sp. e Delftia acidovorans foram responsáveis pela desnitrificação incompleta do nitrato para nitrito. Portanto, as espécies de Acidovorax estavam presentes nas amostras analisadas neste estudo e poderiam estar envolvidas na desnitrificação que ocorreu no reator de lote.
Estirpes bacterianas não cultivadas da Família Rhodocyclaceae foram identificadas com 98% de semelhança (clone 9 – AY945917.1 e clones 46, 84 AY945905), como mostra a Tabela 1. Os membros da Família Rhodocyclaceae são bactérias Gram-negativas pertencentes à classe Betaproteobactérias. São varetas aeróbias desnitrificantes com capacidade metabólica versátil. A maioria das espécies vive em habitats aquáticos e condições oligotróficas do solo. Muitas delas ocorrem em águas residuais e desempenham um papel importante no tratamento biológico de descontaminação desses locais (http://en.wikipedia.org/wiki/Rhodocyclaceae). Liu et al. (2006), alimentaram um reactor desnitrificador com quinolina (40 mg/L) uma amina tóxica utilizada na fabricação de corantes, pesticidas e combustíveis sintéticos, glucose (180 mg/L), nitrato e fosfato de potássio (C/N/P de 150:30:1). O inóculo era do segundo tanque de sedimentação do sistema de tratamento de esgoto da Indústria de Coqueificação de Xangai & Chemical Factory (Wujing, Xangai – Japão). A remoção da quinolina foi de 90,2% após o período do reator de estado estacionário (6 semanas). As análises biológicas moleculares do inóculo e do reactor desnitrificante revelaram bactérias não cultivadas, Thauera e Azoarcus em ambos os testes. Segundo os autores, as porcentagens de clones afiliados às bactérias pertencentes ao Azoarcus e ao Thauera foram de 74% no reator desnitrificador e 4% no inóculo, respectivamente. O conhecimento de microorganismos de amostras ambientais depende das condições laboratoriais com culturas puras (Pace, 1997). Entretanto, menos de 1% das bactérias de diferentes ecossistemas são conhecidas (Amann, 1995), ou aproximadamente 99% não foram estudadas e identificadas. Portanto, neste trabalho esperamos obter sequências semelhantes de bactérias não cultivadas.
A árvore filogenética obtida com primers de domínio de bactérias consensuais nas análises de biologia molecular do experimento é ilustrada na Figura 4.
Os coeficientes de similaridade entre os diferentes grupos de microorganismos foram de 97% a 99% e indicaram a presença de espécies filogenéticas, com base em 16S rRNA seqüências de avaliação parcial do gene. As seqüências de espécies conhecidas foram da base de dados NCBI com Aspergillus niger (FJ828924.1) como uma seqüência fora de grupo de.
Por isso, as espécies Acidovorax, Comamonas e Acinetobacter identificadas neste estudo estavam presentes no sistema de lodo ativado da Volkswagen São Carlos Motors e poderiam estar envolvidas na redução de nitrato e no consumo de etanol.
CONCLUSÕES
O potencial do inóculo de um sistema de lodo ativado e o uso de etanol como fonte de carbono em um processo de desnitrificação foram demonstrados em um reator descontínuo.
Os valores das bactérias desnitrificantes MPN obtidos neste estudo, combinados com os resultados para a remoção do nitrato, revelaram que havia bactérias desnitrificantes no inóculo de um sistema de lodo ativado, as quais foram favorecidas pelas condições nutricionais impostas.
Os clones identificados tinham afiliação filogenética na classe Proteobacteria phylum, Alphaproteobacteria e Gamaproteobacteria, com Acidovorax sp.., Acinetobacter sp., Comamonas sp. e bactérias não cultivadas. Estas bactérias poderiam estar envolvidas na redução de nitrato e no consumo de etanol em reator de lote anóxico.
ACENTECIMENTOS
Os autores agradecem os subsídios recebidos da FAPESP e CNPq.
APHA, AWWA e WEF, métodos padrão para o exame de água e águas residuais. 22ª edição, American Public Health Association, Washington, DC (2005).
Iamamoto, C. Y., Remoção de nitrogênio no seqüenciamento de reator batch com biomassa em suspensão tratando águas residuárias com alta concentração de amoníaco. Tese de Doutorado, Universidade de São Paulo, Brasil, Escola de Engenharia, Universidade de São Carlos, Brasil (2006).
Messing, J., Novos vetores M13 para clonagem. Métodos em Enzimologia, 101 20-78 (1983).
Pace, N. R., A molecular view of microbial diversity and the biosphere. Science, 276, 734-740 (1997).