Abstract

Com a separação cada vez melhorada de amostras complexas e detecção de capacidades de materiais desconhecidas, a cromatografia líquida acoplada à espectrometria de massa (LC-MS) tem sido amplamente utilizada na pesquisa da medicina tradicional chinesa (MTC). Este artigo descreve os princípios da cromatografia líquida (LC) e da espectrometria de massa (EM) e suas vantagens e desvantagens na análise qualitativa e quantitativa da MTC. Recuperamos literaturas de pesquisa sobre a aplicação da LC-MS em MTC publicadas durante os últimos cinco anos no país e no exterior. Para melhor orientar a análise de MTC, esta revisão foca principalmente na categoria de aplicações de MTC, quantas vezes diferentes tipos de MTC são utilizados, e a capacidade qualitativa e quantitativa de vários MTC no estudo de MTC.

1. Introdução

Milhares de anos de acumulação de experiência de vida e doença feita pelos nossos antepassados finalmente traduzida em uma farmácia moderna. As ervas chinesas, com ingredientes complexos e variados, são geralmente postas em prática por prescrição, seguindo as regras do monarca, ministro, assistente e guia. Quando aplicadas, a quantidade de ervas únicas e formulações farmacêuticas pode variar, o que pode levar a mudanças na interação entre os medicamentos e o princípio ativo. Em diferentes locais de aplicação dos medicamentos, haverá diferenças nos ingredientes. Devido à complexidade da composição química da MTC, diferentes composições químicas também podem reagir umas com as outras. Embora a aplicação prática tenha provado a eficácia da MTC, ainda é difícil explicar os princípios ativos específicos dos medicamentos da MTC na ciência moderna. Nos últimos anos, o metabolismo in vivo de um composto e o mecanismo de ação se tornaram um tema quente da pesquisa da medicina chinesa. Mas suas características, tais como composição complexa, mecanismo de ação múltipla e multimodo de ação e papel dos ingredientes, dão à pesquisa de MTC um certo grau de dificuldade.

LC-MS integra totalmente a alta capacidade de separação da amostra de MTC para amostras complexas e a forte capacidade qualitativa da EM. Devido à sua alta sensibilidade e seletividade, a técnica LC-MS tem sido amplamente utilizada na pesquisa de MTC .

2. LC

Cromatografia separa a mistura utilizando as diferenças do coeficiente de distribuição entre as duas fases (fase móvel e fase estacionária). De acordo com o estado da fase móvel, a cromatografia pode ser dividida em cromatografia gasosa, cromatografia líquida e cromatografia de fluidos supercríticos, enquanto que, de acordo com as formas geométricas da fase estacionária, a cromatografia pode ser dividida em cromatografia em coluna, cromatografia em papel e cromatografia de camada fina. O método LC mais comumente utilizado é a cromatografia em coluna que considera o líquido como uma fase móvel. A cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC) é modificada com base na cromatografia clássica de coluna líquida.

A aplicação da LC é dividida em duas categorias. Uma delas é qualitativa ou quantitativa para uma determinada composição. A qualificação é gerenciada de acordo com a consistência entre a amostra e o componente alvo no momento de pico. A quantificação é realizada de acordo com a curva padrão gerada após a injeção dos padrões em diferentes níveis de concentração. A outra é uma impressão digital que se refere à noção de que, após a amostra de impressão digital ter sido descartada de alguma forma, podemos obter cromatograma ou espectrograma rotulado características químicas utilizando determinados métodos de análise.

LC tem uma grande vantagem na capacidade de separar amostras complexas, por isso é a opção mais eficaz quando aplicada para separar misturas, mas não é adequado para obter informações estruturais do material . A qualificação terminada pelo contraste entre as posições de pico de compostos desconhecidos e os padrões não está disponível para o monitoramento de compostos desconhecidos.

3. MS

A espectrometria de massa é amplamente utilizada no campo da pesquisa de MTC devido à sua alta seletividade, alta sensibilidade e capacidade de fornecer informações incluindo massa molecular relativa e características estruturais. A MS completa a qualificação usando massa molecular e informações estruturais relevantes e completa a quantificação pelas relações do pico e conteúdo composto que o pico representou. A ionização por pressão atmosférica (API) da EM tem ionização por electrospray (ESI) e ionização química por pressão atmosférica (APCI). Para muitos tipos de compostos, o ESI tem alta sensibilidade. Em comparação com o ESI, o APCI é adequado para os compostos menos polares e para a análise de compostos voláteis. Dependendo das diferenças entre os analisadores de massa utilizados, a EM comum conclui espectro de massa quadripolar (Q-MS), espectro de massa de tempo de vôo (TOF-MS), e espectrometria de massa de armadilha iônica (IT-MS) .

Espectrometria de massa tandem refere-se a duas ou mais EM trabalhando juntas. A espectrometria de massa tandem mais comumente utilizada é a espectrometria de massa tri-quadrupole (QQQ-MS). A fim de utilizar a espectrometria de massa quadrupolar para realizar a espectrometria de massa em múltiplas etapas, são colocados sequencialmente três quadrupolares, que é o quadrupolar triplo. Outro tipo de espectrometria de massa tandem, como a espectrometria de massa quadrupole-time-of-flight (Q-TOF-MS) e a espectrometria de massa quadrupole-ion trap tandem (Q-IT-MS), também consiste em uma variedade de séries de analisadores de qualidade . As séries temporais de armadilhas de íons podem alcançar varreduras MS em várias etapas sequencialmente em diferentes momentos, por isso este estudo classificou o IT-MS como espectrômetro de massa em tandem.

Espectrometria de massa tandem pode induzir fragmentos de íons moleculares gerados pela EM em primeiro estágio, de acordo com a qual podemos inferir a relação entre a criança e os pais, obter informações estruturais da molécula e então sugerir a estrutura do composto, e conduzir a análise de qualidade para compostos conhecidos e desconhecidos com mais precisão.

Embora a EM possa fornecer informações estruturais de um material, ela requer maior pureza para a amostra. Na pesquisa de MTC, ele é geralmente usado em combinação com LC.

4. LC-MS

LC-MS técnica, usando LC como sistema de separação e MS como sistema de detecção, finalmente atinge o espectro. Quando a LC e a MS trabalham em conjunto, podem realizar MS em várias etapas para especular a estrutura do composto, terminando assim a análise qualitativa e quantitativa com maior precisão .

Retrievendo os trabalhos sobre LC-MS na aplicação das literaturas de pesquisa de MTC publicadas durante os últimos cinco anos no país e no exterior, descobrimos que elas poderiam ser separadas em duas categorias, ou seja, LC-Q-MS e LC-MS/MS. A fim de analisar as diferenças e as vantagens e desvantagens de cada método, os trabalhos foram classificados de acordo com a diferença da espectrometria de massa tandem.

4.1. LC-Q-MS

LC-Q-MS pode ser usado para conduzir análises qualitativas e quantitativas para componentes padrão, como mostrado na Tabela 1. Ao realizar a análise qualitativa, podemos obter informações estruturais através de iões positivos ou negativos de varrimento . Também podemos deixar claro a que tipo de substância a estrutura química pertence, comparando-a com as literaturas padrão . O LC-Q-MS quantifica os compostos com base na seleção de íons específicos para monitoramento . Na ausência de padrões, a LC-Q-MS pode realizar a análise qualitativa da substância utilizando fortes características qualitativas da espectrometria de massa .

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Padrão Medicina chinesa tradicional Qualitativa Quantitativa Ref.
5-HT e NE Rhodioloside + +
Calycosin-7-O-β-D-glucoside, e assim por diante Tou nong san + –
Ácido salvianólico D Salvianólico ácido D + +
Tabela 1
LC-Literaturas de pesquisa da Q-MS sobre a aplicação da medicina tradicional chinesa publicadas durante os últimos cinco anos, no país e no estrangeiro.

LC-Q-MS pode analisar substâncias qualitativamente, mas alguns isómeros ou substâncias de peso molecular idêntico precisam de ser mais explorados, cujas estruturas necessitam de ser mais bem identificadas por referência à espectrometria de massa em várias etapas. Além disso, uma qualificação imprecisa leva a um viés de quantificação.

4.2. LC-MS/MS
4.2.1. LC-IT-MS

IT-MS capta diferentes gamas de qualidade de iões fazendo uso de diferentes tamanhos de tensão RF aplicada aos eléctrodos de anel. Tem alta sensibilidade, e um único IT-MS pode alcançar funções de espectrometria de massa multinível .

IT-MS pode realizar varreduras de MS em múltiplos estágios em diferentes ordens cronológicas, fornecendo fragmentação MSn do ingrediente; assim, é adequado para matéria qualitativa, fornecendo informações estruturais para a identificação de composição desconhecida, como mostrado na Tabela 2. No estudo da MTC, a LC-IT-MS é comumente utilizada em composição qualitativa .

Tabela 2
LC-Literaturas de pesquisa da IT-MS na aplicação da medicina tradicional chinesa publicadas durante os últimos cinco anos no país e no estrangeiro.

4.2.2. LC-QQQ-MS

Triplo quadrupole significa que três quadruplos são colocados em ordem. Cada quádruplo tem uma função separada. Os modos de varredura de quadrupol triplo incluem o modo de varredura completa, modo de varredura de íons do produto, modo de varredura de íons pai, modo de varredura de perda neutra, modo de varredura de íons selecionados e modo de varredura de monitoramento de reações múltiplas .

LC-QQQ-MS é usado principalmente para quantificação , como mostrado na Tabela 3. Alguns estudos são usados para quantificação . Em comparação com LC-Q-MS, LC-QQQ-MS pode selecionar determinados íons para colidir e analisar os fragmentos após a colisão. O LC-QQQ-MS pode detectar o íon pai e o íon filha ao mesmo tempo, portanto é preciso, sensível e abrangente. O LC-QQQ-MS pode ser aplicado a uma gama mais ampla. Em comparação com outros espectrômetros de massa tandem, o quadrupolo triplo tem a melhor reprodutibilidade quantitativa. LC-QQQ-MS é o método quantitativo de substâncias mais comumente conhecido.

Padrão Medicina tradicional chinesa Qualitativa Quantitativa Ref.
Danshensu e assim por diante Comprimidos de jitai + –
Baicalin e assim por diante Huangqin tang + –
– Shu-cápsula yu + –
Ginsenosídeo Rg1 e assim por diante Si-ni decocção fórmulas análogas + –
Ácido ganodérico A e assim por diante Ganoderma lucidum + – >
Ácido protocatequico e assim por diante Injeção de Danmu + –
Tabela 3
LC-Literaturas de pesquisa da QQQ-MS na aplicação da medicina tradicional chinesa publicadas durante os últimos cinco anos no país e no estrangeiro.

4.2.3. LC-Q-TOF-MS

LC-Q-TOF-MS é geralmente usado para a qualificação. Possui maior sensibilidade de detecção e resolução de massa. LC-Q-TOF-MS pode medir com precisão a massa .

LC-Q-TOF-MS é usado principalmente para análise qualitativa de materiais , como mostrado na Tabela 4. Em comparação com vários outros espectros de massa em tandem, tem vantagens na sensibilidade de detecção, precisão de massa e resolução. Alta resolução e precisão de massa dão à LC-Q-TOF-MS melhor capacidade qualitativa para íons fragmentos. É também mais persuasivo ao distinguir a estrutura dos iões e isómeros, além de analisar estruturas desconhecidas neste método.

Padrão Medicina tradicional chinesa Qualitativa Quantitativa Ref.
Ginsenosídeos Rc e CK Plantas do gênero Panax + +
Protopine e assim por diante Jitai comprimido + +
Rutina R1 e assim por diante Actinidia valvata leaves + +
Neobavaisoflavone e assim por diante Psoralea corylifolia L. + +
– Eclipta prostrata L. + +
Naringin e assim por diante Chaihu-shu-gan-san + +
Psoralen e assim por diante Bushen zhuanggu fórmula + + >> >
Berberina e assim por diante Huang lian jie du decoction + +
Fuzilina e assim por diante Mahuang-fuzi-xixin decoction + +
Rutin Ginkgo biloba L. + +
Liquiritina e assim por diante Gan-sui-ban-xia decocção mais menos gansui e combinação de drogas gancao + +
(-)-Epigalocatequina e assim por diante Ginkgo biloba folhas + +
Pedunculósido e assim por diante Ilex rotunda + +
Ácido gálico e assim por diante Guizhi fuling wan + –
Matrine e assim por diante Yandureqing + –
Tabela 4
LC-Literaturas de pesquisa Q-TOF-MS sobre a aplicação da medicina tradicional chinesa publicadas durante os últimos cinco anos no país e no estrangeiro.

5. Conclusões

Comparado com LC-MS e LC-MS/MS, a pesquisa de LC-MS/MS é conduzida relativamente mais, o que tem uma maior precisão de análise qualitativa para compostos conhecidos e desconhecidos. O LC-IT-MS, devido à sua capacidade de múltiplos níveis de espectrometria de massa, tem um melhor desempenho na avaliação de uma estrutura de composição desconhecida. O LC-Q-IT-MS tem uma melhor qualidade de resolução do que o LC-IT-MS. Em comparação com os outros três tipos de LC-MS/MS, verificou-se que o LC-QQQ-MS foi mais frequentemente aplicado para pesquisa, com uma melhor capacidade quantitativa do que outros. Sua capacidade qualitativa é boa, mas ainda não tão boa quanto a LC-Q-TOF-MS. O LC-Q-TOF-MS é utilizado principalmente para a análise qualitativa da matéria. Algumas de suas habilidades são relativamente excelentes, como a sensibilidade de detecção, precisão de massa e resolução.

Os métodos qualitativos são diferentes entre os diferentes métodos LC-MS, enquanto os métodos quantitativos são basicamente os mesmos, pois todos os métodos quantitativos requerem padrão com concentrações diferentes. Os métodos quantitativos são geralmente divididos em dois tipos diferentes: o método padrão externo e o método padrão interno. O método padrão externo significa que, para conduzir a análise quantitativa, uma curva padrão é gerada primeiramente cujo eixo horizontal representa as concentrações e o eixo vertical representa a área de espectros de pico de cor. Em seguida, de acordo com a área do pico, a análise qualitativa pode ser feita. Método padrão interno significa que o padrão interno com concentração conhecida é adicionado primeiro às soluções de amostra e substância de referência híbrida; em seguida, é gerada uma curva padrão cujo eixo horizontal representa a razão entre a concentração da amostra de referência e a concentração do padrão interno e o eixo vertical representa a razão entre a área do pico do padrão padrão e a área do pico do padrão interno. Finalmente, a amostra do padrão interno é injetada. De acordo com a área de pico dos indicadores de teste e o padrão interno, a análise qualitativa pode ser feita.

Na pesquisa de MTC, conclui-se que a LC-Q-TOF-MS é uma melhor escolha na análise qualitativa, enquanto a LC-QQQ-MS se mostra melhor para a análise quantitativa. A análise quantitativa é realizada utilizando um padrão específico com concentração específica. A análise qualitativa pode medir a estrutura de alguns ingredientes desconhecidos e especular suas atribuições de acordo com as informações fornecidas pelas literaturas de pesquisa e banco de dados existentes. A validação padrão é a mais precisa para material qualitativo. Devido à composição complexa e capacidades desconhecidas da MTC, os métodos de investigação ainda não podem, relativamente, satisfazer a necessidade. Mais pesquisa e exploração ainda são necessárias.

Interesses concorrentes

Todos os autores declaram que não têm interesses concorrentes.

Conhecimento

Este trabalho é apoiado pela National Natural Science Foundation of China (no. 81273925).

Padrão Medicina chinesa tradicional Qualitativa Quantitativa Ref.
Fuzilina e assim por diante Mahuang-fuzi-Decocção xixin + –
Catalpol e assim por diante Jieduquyuziyin prescrição + –
Chrysoeriol-7-O-glucósido e assim por diante Lonicerae macranthoides + –
Amygdalin e assim por diante San-ao-tang + –
Nicotinate e assim por diante Saikosaponins + –
Betaine e assim por diante Hu-gan-kang-cápsulas de yuan + –
Ácido clorogénico e assim por diante Pílula gota de yinhuang + +
– Bufeiyishen fórmula + –
Ácido ferúlico e assim por diante Rizoma Chuanxiong + – >
Ononina e assim por diante Comprimido de fengtong de calibre + –
Columbamina e assim por diante Raízes de Franch Coptis chinensis. + –
Grosvenorina I e assim por diante Siraitiae fructus + +