dNTP significa trifosfato de nucleótido de desoxirribose empregado na PCR para expandir a cadeia de ADN em crescimento. dATP, dTTP, dGTP e dTTP são quatro dNTPs comuns usados na PCR.
A função dos dNTPs na PCR é expandir a cadeia de ADN em crescimento com a ajuda da Taq DNA polimerase. Ela liga-se com a fita de ADN complementar por ligações de hidrogénio.
A PCR é uma técnica in vitro de síntese de ADN. O objetivo de realizar a PCR é gerar múltiplas cópias de fragmentos de DNA de nosso interesse para visualizá-lo sob a eletroforese em gel.
O objectivo da PCR é fazer milhões de cópias de ADN para várias aplicações a jusante como sequenciação de ADN ou microarranjo de ADN.
A reacção em cadeia da polimerase é a ferramenta inigualável utilizada em investigação genética molecular desde a sua descoberta. Modelo de DNA, primers, tampão, Taq DNA polimerase e dNTPs são os ingredientes da PCR. Para entender o mecanismo da PCR, devemos aprender a importância de cada ingrediente usado nela,
Neste artigo, estamos discutindo um dos ingredientes chave da PCR que são os dNTPs. Também vamos analisar a sua estrutura e porque é tão importante.
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Outras vezes, também vamos falar sobre o mecanismo de interacção dos dNTPs e Taq DNA polimerase e o seu trabalho na cadeia de ADN em crescimento,
Outras vezes, vamos falar sobre o mecanismo de como os dNTPs e DNA polimerase interagem e ajudam a crescer a cadeia de ADN,
Leia mais sobre artigos relacionados com PCR,
- Rolação de DMSO em PCR: DMSO a PCR enhancer
- Função da taq DNA polimerase em PCR
- Orientações de desenho do primer de PCR
- Role of MgCl2 in PCR reaction
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O que são dNTPs?
Estrutura dos dNTPs:
O dNTP significa trifosfato de nucleótidos de desoxirribose.
Em primeiro lugar, temos de compreender várias terminologias básicas como base, nucleótidos, nucleósidos, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos dideóxidos de modo a compreender os dNTPs. Estes são alguns termos básicos usados rotineiramente na genética, ainda assim, as pessoas entenderam mal.
A Adenina e a Guanina são bases purinas enquanto a Citosina e a Tiamina são bases pirimidinas. As bases nitrogenadas não podem formar ADN directamente. A espinha dorsal do fosfato e o açúcar pentose são adicionalmente necessários para criar uma molécula de ADN.
O nucleotídeo é composto por um açúcar pentose, fosfato e base nitrogenada. Um nucleotídeo liga-se com outro nucleotídeo adjacente com ligação fosfodiéster, enquanto um nucleotídeo liga-se com outro nucleotídeo na cadeia de ADN oposta com ligações de hidrogénio.
A imagem representa a estrutura do trifosfato de desoxirribose, difosfato e monofosfato.
Leia mais sobre a estrutura do ADN: A história do ADN: A estrutura e função do DNA
O fosfato presente no nucleotídeo é trifosfato, (tri- três) quando o fosfato não está ligado ao nucleotídeo (ou ausente), é chamado de nucleósido (nucleotídeo sem fosfato é chamado de nucleósido).
Quando um átomo de hidrogênio substitui o grupo hidroxila no açúcar pentose, o açúcar é chamado de açúcar deoxy. O DNA é composto de açúcar pentose desoxídico enquanto o RNA é composto do único açúcar ribose.
Os dNTPs são a cadeia de nucleotídeos composta de ribose, base nitrogenada e fosfato.
Outros, os ddNTPs são diferentes dos dNTPs.
O trifosfato de dideoxinucleotídeos não tem grupo 3′ OH livre, outro 3′ OH grupo de açúcar é substituído pelo hidrogênio.
Hence que não pode causar a expansão de um fio de ADN em crescimento. Portanto, estes tipos de ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP são utilizados no sequenciamento de ADN. Vamos discutir o papel dos ddNTPs no sequenciamento elaborado em outro artigo.
Os ddNTPs são usados no método de terminação em cadeia para parar a expansão da síntese de DNA.
A imagem representa a diferença entre açúcar Ribose, açúcar desoxirribose e açúcar desoxirribose.
O trifosfato é composto por três moléculas diferentes de fosfato que fornece uma espinha dorsal para o DNA.
A espinha dorsal de fosfato do DNA tem três moléculas diferentes de fosfato chamadas alfa, beta e fosfato gama. Quando um fosfato ou fosfato gama é liberado, a estrutura é chamada de difosfato de desoxinucleotídeo.
Similiarmente quando dois dos três fosfatos liberados a estrutura é chamada de monofosfato de desoxinucleotídeo.
dATP e dGTP são purinas enquanto dCTP e dTTP são dNTPs de pirimidina usados na reacção PCR. A função dos dNTPs em PCR é a mesma da replicação in vivo. Se estiver interessado em ler as diferenças entre nucleotídeos vs nucleósidos e purinas vs pirimidinas, leia estes artigos:
- Purinas Vs Pyrimidines
- Nucleotídeos Vs Nucleosídeos
A imagem representa quatro estruturas diferentes de dNTPs.
A função dos dNTPs:
Os dNTPs são os ingredientes da PCR, RT-PCR, sequenciação de ADN ou microarranjo de ADN que ajuda a fazer crescer o ADN ou amplificação de ADN.
Mecanismo de acção:
O processo de PCR é dividido em três etapas dependentes da temperatura:
- Denaturação
- Annealing
- Extensão.
No passo de desnaturação, o ADN de cadeia dupla é desnaturado em ADN de cadeia simples; No passo de recozimento, o primer liga-se na posição exacta de onde a sua sequência complementar está presente e,
No passo de extensão, a Taq DNA polimerase adiciona os dNTPs na cadeia de ADN em crescimento.
A partir do momento em que o cordão é aberto e o primer se liga com DNA de cadeia única, a Taq DNA polimerase inicia sua atividade catalítica.
A Taq DNA polimerase usa o DNA de cadeia única como substrato para a atividade enzimática e se estabelece na junção primer-DNA.
A única extremidade da Taq DNA polimerase liga-se perto do grupo 3′ OH do primer oligonucleotídeo, este complexo é chamado de complexo P- DNA.
A imagem representa a estrutura do ADN com ligações de hidrogénio e a ligação fosfodiéster do ADN.
No passo seguinte, a adição de dNTP começou.
O dNTP liga-se com o complexo P-DNA com fraca afinidade se o nucleótido complementar exacto estiver presente. Logo após a polimerase da Taq DNA a detém e ocorre a interação da ligação de hidrogênio entre uma base complementar e o dNTP.
Aqui, no início, não todo o nucleotídeo, mas a base (base nitrogenada) presente no dNTP decide se liga ou não.
Primeiro, se encontrar a base complementar no modelo ssDNA (A para T e G para C), irá formar as ligações de hidrogênio entre eles. Três ligações de hidrogênio entre C e G e duas ligações de hidrogênio entre A e T são fabricadas.
Após as formas de ligação de hidrogênio, a Taq DNA polimerase conforma essa ligação de dNTP com o fio de DNA em crescimento, formando uma ligação fosfodiéster. Agora, após a formação da ligação fosfodiéster, a Taq DNA polimerase move-se um passo à frente para a adição de novos dNTP.
A ligação fosfodiéster é formada entre 3′ OH de primer e 5′ P de dNTP.
Após a formação da ligação de hidrogênio, a Taq DNA polimerase catalisa a reação pela remoção da gama e do beta-fosfato do trifosfato do dNTP. Dois pirofosfatos (PPi) são liberados após a conclusão da reação.
A cinética exacta de como os dNTPs e a Taq polimerase interagem durante a reacção PCR ainda não é conhecida.
Ler mais sobre uma electroforese em gel de agarose,
- Electroforese em gel de agarose
- Corante de carga de gel de DNA
- Papel de EtBr na electroforese em gel de agarose
A concentração de dNTPs em PCR:
Em geral, para a reacção de PCR com 30 a 35 ciclos de execução, 200μM de cada dNTPs são suficientes.
200μM cada, o que significa que um total de 800μM de 4 misturas de dNTPs é utilizado numa única reacção de PCR. Temos de preparar a nossa concentração de trabalho a partir da solução de reserva de 100mM. No entanto, nos últimos dias a mastermix pronta a usar é muito popular e eficaz. A mastermix pronta a usar contém todos os ingredientes importantes como a mistura de dNTPs, corante de carregamento de gel e Taq DNA polimerase.
Como somos um estudante de ciências temos de nos inclinar, como preparar a solução de trabalho do caldo. Suponha que temos que preparar 2mM de trabalho a partir dos 100mM de caldo.
>222222>now,
Remember V1C1= V2C2?
Aqui, a concentração dada C1 é 100mM (que é a concentração de estoque de dNTPs)
V1 é o volume dado é desconhecido (?)
C2 é a concentração requerida = 2mM
V2 é o volume requerido= 1000μL
Agora V1C1= V2C2
V1= V2C2/ C1
>222222>V1= 1000 * 2/ 100>222222>V1= 20μL>222222>Aqui, 20μL de cada dNTPs necessários para a preparação da solução de trabalho, por isso o volume final para a nossa mistura é 80μL de (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) em 920μL de D/W. Esta fará a concentração final de 2mM de cada dNTP em 1000μL da solução de trabalho. Calcule para 200μM por si mesmo.
O meu guia final para usar dNTPs em PCR
Prepare sempre dois tubos de solução de reserva e armazene todos os tubos a -20°C.
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Calcule quantas reacções executa numa semana de forma adequada prepare a solução de trabalho a partir do stock e guarde-a a 4°C. Porque o congelamento e descongelamento repetidos diminuirão a actividade dos dNTPs.
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Visto que a contaminação do ADN estranho irá dificultar a reacção de PCR.
A concentração 200μM é suficiente para a reacção PCR, no entanto, para a PCR de longo alcance pode ser usada uma concentração de 2mM a 3 mM de cada dNTP.
As concentrações de dNTPs aumentam a taxa de ligação não específica aumentará. Da mesma forma, a escassez de dNTPs leva a produtos de PCR incompletos. Portanto, use sempre uma quantidade apropriada de dNTPs.
Conclusão: Com a ajuda da Taq, os dNTPs ligam-se com a cadeia de ADN em crescimento e expandem-na. Se você não quiser mexer em tudo isso, você pode usar o kit de PCR pronto para usar, que é mais preferível. No entanto, você tem que aprender o método manual de preparação de reagentes.
Estrutura dos dNTPs:
O dNTP significa trifosfato de nucleótidos de desoxirribose.
Em primeiro lugar, temos de compreender várias terminologias básicas como base, nucleótidos, nucleósidos, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos dideóxidos de modo a compreender os dNTPs. Estes são alguns termos básicos usados rotineiramente na genética, ainda assim, as pessoas entenderam mal.
A Adenina e a Guanina são bases purinas enquanto a Citosina e a Tiamina são bases pirimidinas. As bases nitrogenadas não podem formar ADN directamente. A espinha dorsal do fosfato e o açúcar pentose são adicionalmente necessários para criar uma molécula de ADN.
O nucleotídeo é composto por um açúcar pentose, fosfato e base nitrogenada. Um nucleotídeo liga-se com outro nucleotídeo adjacente com ligação fosfodiéster, enquanto um nucleotídeo liga-se com outro nucleotídeo na cadeia de ADN oposta com ligações de hidrogénio.
A imagem representa a estrutura do trifosfato de desoxirribose, difosfato e monofosfato.
Leia mais sobre a estrutura do ADN: A história do ADN: A estrutura e função do DNA
O fosfato presente no nucleotídeo é trifosfato, (tri- três) quando o fosfato não está ligado ao nucleotídeo (ou ausente), é chamado de nucleósido (nucleotídeo sem fosfato é chamado de nucleósido).
Quando um átomo de hidrogênio substitui o grupo hidroxila no açúcar pentose, o açúcar é chamado de açúcar deoxy. O DNA é composto de açúcar pentose desoxídico enquanto o RNA é composto do único açúcar ribose.
Os dNTPs são a cadeia de nucleotídeos composta de ribose, base nitrogenada e fosfato.
Outros, os ddNTPs são diferentes dos dNTPs.
O trifosfato de dideoxinucleotídeos não tem grupo 3′ OH livre, outro 3′ OH grupo de açúcar é substituído pelo hidrogênio.
Hence que não pode causar a expansão de um fio de ADN em crescimento. Portanto, estes tipos de ddATP, ddTTP, ddCTP e ddGTP são utilizados no sequenciamento de ADN. Vamos discutir o papel dos ddNTPs no sequenciamento elaborado em outro artigo.
Os ddNTPs são usados no método de terminação em cadeia para parar a expansão da síntese de DNA.
A imagem representa a diferença entre açúcar Ribose, açúcar desoxirribose e açúcar desoxirribose.
O trifosfato é composto por três moléculas diferentes de fosfato que fornece uma espinha dorsal para o DNA.
A espinha dorsal de fosfato do DNA tem três moléculas diferentes de fosfato chamadas alfa, beta e fosfato gama. Quando um fosfato ou fosfato gama é liberado, a estrutura é chamada de difosfato de desoxinucleotídeo.
Similiarmente quando dois dos três fosfatos liberados a estrutura é chamada de monofosfato de desoxinucleotídeo.
dATP e dGTP são purinas enquanto dCTP e dTTP são dNTPs de pirimidina usados na reacção PCR. A função dos dNTPs em PCR é a mesma da replicação in vivo. Se estiver interessado em ler as diferenças entre nucleotídeos vs nucleósidos e purinas vs pirimidinas, leia estes artigos:
- Purinas Vs Pyrimidines
- Nucleotídeos Vs Nucleosídeos
A imagem representa quatro estruturas diferentes de dNTPs.
A função dos dNTPs:
Os dNTPs são os ingredientes da PCR, RT-PCR, sequenciação de ADN ou microarranjo de ADN que ajuda a fazer crescer o ADN ou amplificação de ADN.
Mecanismo de acção:
O processo de PCR é dividido em três etapas dependentes da temperatura:
- Denaturação
- Annealing
- Extensão.
No passo de desnaturação, o ADN de cadeia dupla é desnaturado em ADN de cadeia simples; No passo de recozimento, o primer liga-se na posição exacta de onde a sua sequência complementar está presente e,
No passo de extensão, a Taq DNA polimerase adiciona os dNTPs na cadeia de ADN em crescimento.
A partir do momento em que o cordão é aberto e o primer se liga com DNA de cadeia única, a Taq DNA polimerase inicia sua atividade catalítica.
A Taq DNA polimerase usa o DNA de cadeia única como substrato para a atividade enzimática e se estabelece na junção primer-DNA.
A única extremidade da Taq DNA polimerase liga-se perto do grupo 3′ OH do primer oligonucleotídeo, este complexo é chamado de complexo P- DNA.
A imagem representa a estrutura do ADN com ligações de hidrogénio e a ligação fosfodiéster do ADN.
No passo seguinte, a adição de dNTP começou.
O dNTP liga-se com o complexo P-DNA com fraca afinidade se o nucleótido complementar exacto estiver presente. Logo após a polimerase da Taq DNA a detém e ocorre a interação da ligação de hidrogênio entre uma base complementar e o dNTP.
Aqui, no início, não todo o nucleotídeo, mas a base (base nitrogenada) presente no dNTP decide se liga ou não.
Primeiro, se encontrar a base complementar no modelo ssDNA (A para T e G para C), irá formar as ligações de hidrogênio entre eles. Três ligações de hidrogênio entre C e G e duas ligações de hidrogênio entre A e T são fabricadas.
Após as formas de ligação de hidrogênio, a Taq DNA polimerase conforma essa ligação de dNTP com o fio de DNA em crescimento, formando uma ligação fosfodiéster. Agora, após a formação da ligação fosfodiéster, a Taq DNA polimerase move-se um passo à frente para a adição de novos dNTP.
A ligação fosfodiéster é formada entre 3′ OH de primer e 5′ P de dNTP.
Após a formação da ligação de hidrogênio, a Taq DNA polimerase catalisa a reação pela remoção da gama e do beta-fosfato do trifosfato do dNTP. Dois pirofosfatos (PPi) são liberados após a conclusão da reação.
A cinética exacta de como os dNTPs e a Taq polimerase interagem durante a reacção PCR ainda não é conhecida.
Ler mais sobre uma electroforese em gel de agarose,
- Electroforese em gel de agarose
- Corante de carga de gel de DNA
- Papel de EtBr na electroforese em gel de agarose
A concentração de dNTPs em PCR:
Em geral, para a reacção de PCR com 30 a 35 ciclos de execução, 200μM de cada dNTPs são suficientes.
200μM cada, o que significa que um total de 800μM de 4 misturas de dNTPs é utilizado numa única reacção de PCR. Temos de preparar a nossa concentração de trabalho a partir da solução de reserva de 100mM. No entanto, nos últimos dias a mastermix pronta a usar é muito popular e eficaz. A mastermix pronta a usar contém todos os ingredientes importantes como a mistura de dNTPs, corante de carregamento de gel e Taq DNA polimerase.
Como somos um estudante de ciências temos de nos inclinar, como preparar a solução de trabalho do caldo. Suponha que temos que preparar 2mM de trabalho a partir dos 100mM de caldo.
>222222>now,
Remember V1C1= V2C2?
Aqui, a concentração dada C1 é 100mM (que é a concentração de estoque de dNTPs)
V1 é o volume dado é desconhecido (?)
C2 é a concentração requerida = 2mM
V2 é o volume requerido= 1000μL
Agora V1C1= V2C2
V1= V2C2/ C1
>222222>V1= 1000 * 2/ 100>222222>V1= 20μL>222222>Aqui, 20μL de cada dNTPs necessários para a preparação da solução de trabalho, por isso o volume final para a nossa mistura é 80μL de (dATP, dCTP, dGTP e dTTP) em 920μL de D/W. Esta fará a concentração final de 2mM de cada dNTP em 1000μL da solução de trabalho. Calcule para 200μM por si mesmo.
O meu guia final para usar dNTPs em PCR
Prepare sempre dois tubos de solução de reserva e armazene todos os tubos a -20°C.
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Calcule quantas reacções executa numa semana de forma adequada prepare a solução de trabalho a partir do stock e guarde-a a 4°C. Porque o congelamento e descongelamento repetidos diminuirão a actividade dos dNTPs.
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Visto que a contaminação do ADN estranho irá dificultar a reacção de PCR.
A concentração 200μM é suficiente para a reacção PCR, no entanto, para a PCR de longo alcance pode ser usada uma concentração de 2mM a 3 mM de cada dNTP.
As concentrações de dNTPs aumentam a taxa de ligação não específica aumentará. Da mesma forma, a escassez de dNTPs leva a produtos de PCR incompletos. Portanto, use sempre uma quantidade apropriada de dNTPs.