Quando uma bioamostra é criopreservada, o movimento molecular e os processos celulares abrandam até ao ponto de transição vítrea onde toda a actividade pára, preservando células, tecidos e mesmo organismos inteiros durante anos. Consequentemente, não é surpresa que a criopreservação esteja no centro da maioria das operações de biobanking modernas.
Mas mesmo que o conceito de congelamento seja simples, o processo físico é bastante complexo. A forma como o congelamento ou vitrificação ocorre pode ter um impacto dramático na viabilidade das células e na qualidade das amostras quando elas retornam a temperaturas mais quentes.
Estaremos explorando as propriedades físicas do gelo e os principais eventos no congelamento e descongelamento de amostras (que é tão importante quanto o resfriamento) em uma série de posts de blogs que se aprofundam no processo de congelamento. Neste primeiro post, vamos começar no início e dar uma olhada no primeiro passo do congelamento, nucleação.
A água pura resfriada abaixo do ponto de congelamento pode permanecer um líquido super resfriado até que seja perturbado. (Este vídeo abaixo oferece uma grande ilustração deste ponto e é uma grande experiência científica em casa para tentar com crianças!)
No vídeo, bater uma garrafa de água fornece um local para formar cristais de gelo, ou em outras palavras, um local para nucleação. A nucleação é um processo onde as moléculas de um líquido começam a se reunir em pequenos grupos, organizando-se de uma forma que irá definir a estrutura cristalina do sólido. Existem dois tipos de nucleação:
- Nucleação heterogênea, que ocorre quando o gelo começa a se formar em torno de um local de nucleação, como uma perturbação física, uma impureza (como o sal) no líquido ou uma irregularidade em um recipiente. Como as amostras biológicas nunca são água pura, elas sempre experimentam uma nucleação heterogênea.
- Nucleação homogênea, que ocorre quando o gelo se forma sem qualquer local de nucleação pré-definido. Água pura irá congelar a aproximadamente -39°C na ausência de locais de nucleação. Na prática, porém, a nucleação homogênea não é frequentemente vista devido à raridade da água completamente pura.
De acordo com uma revisão na revista Cryobiology, “Nucleation of ice is the most significant uncontrolled variable in conventional cryopreservation leading to sample to sample variation in cell recovery, viability and function”. Os autores recomendam o controle do processo de nucleação e listam vários métodos de congelamento, muitos dos quais são comumente usados para aplicações de FIV:
- Semeadura: A introdução de um cristal de gelo externo para promover a nucleação a uma temperatura especificada. Para minimizar os riscos de contaminação, a sementeira é agora feita gerando uma mancha fria no exterior do recipiente, tal como uma pinça fria na lateral de uma palha.
- Nucleantes químicos: Os cristais de nucleação de gelo estão incluídos no meio da amostra. Os nucleantes químicos permitem uma ampla padronização entre os tipos de amostra e são uma área ativa de pesquisa.
- Eletrocongelamento: A eletricidade de alta tensão é utilizada para induzir a formação de gelo.
- Métodos mecânicos: Agitar, bater ou aplicar ultra-som pode ser eficaz para nucleação, mas difícil de padronizar.
- Resfriamento por choque/congelamento por taxa controlada: Expor a amostra a um conjunto rápido de rampas de temperatura pode promover a nucleação. Isto é o que um congelador de taxa controlada faz ao introduzir amostras através do processo de nucleação.
- Mudança de pressão: A nucleação pode ser induzida pressurizando a amostra, reduzindo a temperatura e liberando a pressão.
Para uma excelente introdução às propriedades da formação de gelo em sistemas biológicos e mais sobre o processo de nucleação, veja o capítulo um do texto seminal de 2004 “Life in the Frozen State”, uma leitura altamente recomendada para qualquer pessoa interessada em saber mais sobre esses processos com mais detalhes.