O condensador – diferentes tipos. Contraste no microscópio
No artigo anterior sobre a ocular, eu salientei que a ocular estava normalmente localizada de forma que seu plano focal frontal fosse coincidente com o Plano de Imagem Primário (PIP). O PIP é conjugado com o espécime no conjunto de imagens dos planos conjugados, e por isso é útil para medir características de espécimes microscópicos.
Da mesma forma, o plano focal frontal do condensador é conjugado com o plano focal posterior da objetiva (mas não do espécime) no trem de iluminação dos raios. O condensador, portanto, proporciona um lugar acessível onde podemos alterar ou regular o contraste da imagem, manipulando os raios luminosos de luz. Estes dois princípios surgem do método de iluminação de Köhler, que foi tratado na parte 3 desta série.
A função do condensador
O condensador cumpre duas funções no microscópio. Ele fornece uma área de luz uniformemente iluminada no campo de visão no plano da amostra e ilumina a abertura da objetiva uniformemente com luz de ângulo suficiente, porém controlável. Em segundo lugar, como mencionado acima, fornece um meio de regular o contraste (Bradbury & Evennett, 1996). A forma mais simples de condensador é o espelho côncavo, mas isto não é útil para objetivos acima de NA 0,2 ou mais. Se o seu microscópio tiver um espelho e uma fonte de luz remota, o lado plano do espelho deve ser usado em conjunto com qualquer condensador de subestágio instalado. Isto porque, estritamente falando, o condensador deve receber iluminação paralela e assim trazer esta luz para um foco no plano focal posterior do condensador (onde a amostra está situada).
Tipos de condensador
O tipo de condensador mais utilizado é o condensador Abbe para microscopia de campo brilhante (Figura 1a, 1b). Ele é construído com duas ou três lentes, e a lente superior de foco curto geralmente pode ser virada para fora do caminho óptico (1a), ou desenroscada (1b), a fim de preencher o campo de visão com objetivas de baixa potência. Este simples iluminador será suficiente para a maioria dos tipos de microscopia. Ele foi originalmente projetado para fornecer feixes estreitos (ou “lápis”) de luz oblíqua a partir de uma abertura excêntrica colocada no plano focal frontal do condensador. A figura 1c mostra um simples iluminador Abbe de duas lentes montado num aparelho de subestágio que podia ser rodado e movido excentricamente para fornecer uma iluminação oblíqua. A figura 1d mostra um condensador de baixa potência projetado para preencher completamente o grande campo de visão das objetivas de muito baixa ampliação.
Embora uma abertura numérica possa ser citada para o condensador (geralmente 0,9 NA para condensadores secos e 1,4 NA máximo para tipos de imersão em óleo), estas figuras não dão nenhuma indicação da NA para a qual os raios iluminantes são corrigidos para aberração esférica. Em muitos condensadores simples, um cone sólido de luz para iluminação axial raramente é corrigido para aberração esférica acima de 0,45 NA. Para trabalhos de alta qualidade, e para a resolução da estrutura no limite da resolução, os condensadores devem ser corrigidos em relação às aberrações. Os condensadores totalmente corrigidos, como as objetivas, contêm muitos elementos de lente e podem ser corrigidos quase no mesmo grau. O condensador acromático-planático (1e) é corrigido tanto para aberrações esféricas como cromáticas, e deve ser utilizado para trabalhos da mais alta qualidade, e para fotomicrografia colorida. Os condensadores aplanaticos são corrigidos apenas para aberração esférica.
Os chamados condensadores ‘universais’ (Figura 2) são multi-funcionais. Eles consistem em um disco giratório contendo uma seleção de diafragmas de abertura, filtros, patch stops, placas de fase ou prismas Wollaston para contraste de interferência diferencial (DIC). Esta disposição permite mudar de um método de contraste para outro de forma conveniente e fácil. O batente de remendo de terra escura geralmente só funcionará até NA 0,5 ou por aí. Para utilização com objectivos de NA mais elevados, deve ser utilizado um condensador de terra escura de construção especial (Figura 3). Para detalhes do seu uso, e outros métodos de melhoria de contraste, veja Bradbury & Evennett (1996).
Figure 2. Condensadores universais. A imagem central mostra a tampa superior removida, mostrando o disco giratório onde anulam a fase de abertura, os prismas DIC, os remendos de terra escura, os discos Rheinberg e os filtros de modulação Hoffman. A maioria dos condensadores universais possui uma íris de abertura para trabalho de campo brilhante, vários anéis para contraste de fase e um batente terra escura para terra escura de baixa potência.
Figure 3. Condensadores terra-escura. 3(a) Condensador seco terra-escura. 3(b) & 3(c) Condensadores de imersão em óleo de terra escura. 3(d) Condensador de imersão em óleo de fundo escuro ajustável; este condensador pode ser ajustado para se adaptar a diferentes espessuras de lâmina, para dar uma imagem de fundo escuro de alta qualidade.
Microscópio de luz transmitida e refletida
A disposição do microscópio de luz transmitida exige um condensador separado, uma vez que a luz é primeiramente condensada na amostra (onde a luz interage com a matéria), e então é coletada pela objetiva mais adiante ao longo do eixo óptico.
A situação no microscópio de luz refletida é diferente. Aqui, o percurso do raio é dobrado em torno do eixo da amostra onde a luz é reflectida a partir da sua superfície. A objetiva atua como seu próprio condensador, e o alinhamento do microscópio de luz refletida é muito simplificado (veja os diagramas de raios na parte 2 desta série). Contudo, é difícil aceder ao plano focal posterior da objectiva (plano focal frontal quando usada como condensador), por isso são usadas lentes suplementares para criar uma posição em que a imagem dos diafragmas e filtros são conjugados com o plano focal posterior.
O sistema de luz incidente é muito útil para microscopia de fluorescência, principalmente porque a iluminação da amostra é simples, é mais eficiente (dando imagens mais brilhantes em altas ampliações) e a combinação com outros métodos de contraste por luz transmitida é permitida.
Figure 4. Ilustração de um epi-iluminador para microscopia de luz refletida
Este epi-condensador tem dois tipos de objetivas de luz refletida encaixadas em seu nariz. A objetiva em uso é projetada para a iluminação de terrenos escuros, enquanto as outras duas objetivas que podem ser vistas para o trabalho com luz refletida de campo brilhante. Os colares largos em torno destas duas últimas objetivas permitem que a objetiva seja centrada no eixo óptico. O ‘D’ na caixa do epi-iluminador denota o inserto intercambiável que permite que a unidade seja utilizada para iluminação de campo escuro. Ele pode ser trocado por um espelho plano para microscopia de luz refletida de campo brilhante. O condensador de luz transmitida foi removido de debaixo do estágio.
Se a objetiva atua como seu próprio condensador em microscopia de luz refletida, por que as objetivas não são usadas também para iluminação em microscopia de luz transmitida? Além da dificuldade prática de acesso ao plano focal posterior da objetiva, é difícil colocar as objetivas em uso multifuncional, e o ângulo de iluminação geralmente não é controlável (por um diafragma de íris no plano focal posterior da objetiva).
Princípios básicos de realce de contraste
Visibilidade ou contraste suficiente, é necessário para que percebamos o detalhe na imagem que é resolvido pelos nossos microscópios. A seletividade é importante: precisamos de pelo menos algumas diferenças regionais dentro do objeto, e entre o objeto e o fundo, para discernir o detalhe.
Contraste na imagem é derivado por três meios, seja separadamente ou em combinação. Eles são:
- interacção luz-espécimen,
- manipulação da iluminação, e
- manipulação do meio de gravação da imagem.
Alteração do contraste em parte (c) pode ser conseguida através de revelação fotográfica e/ou impressão, e também usando contraste electrónico de vídeo analógico ou imagens digitais. Contudo, o condensador é instrumental nas partes (a) e (b) para manipular o contraste e a visibilidade na imagem. Mais detalhes sobre os aspectos teóricos e práticos das técnicas de contraste em microscopia óptica podem ser encontrados em Bradbury & Evennett, 1996 e Sanderson, 2002, 2000, 1998 e 1994. Resumidamente, as formas mais conhecidas de geração de contraste são campo brilhante, iluminação oblíqua, terra escura & Rheinberg, contraste de fase e DIC. Também é possível combinar estes métodos com diferentes formas de iluminação (por exemplo, luz polarizada com Rheinberg, ou contraste de fase por campo brilhante transmitido com fluorescência incidente). Uma vez que o melhoramento do contraste está muito sob o controlo do microscópio, a importância do uso adequado do condensador não pode ser enfatizada em demasia.
O condensador tem de ser focalizado correctamente (ver parte 3, configurar o microscópio para a iluminação Köhler) de forma a obter a melhor qualidade de imagem. Isto é verdade qualquer que seja o método de melhoria de contraste (campo brilhante, fase, terra escura) utilizado. O efeito mais óbvio de um condensador desfocado no microscópio de campo brilhante é uma perda significativa da potência de resolução, dando, por sua vez, uma imagem ‘podre’ com auréolas difractivas à volta de cada ponto da imagem. O mesmo resultado ocorre se a lente superior (foco curto) é omitida ou deixada virada para fora quando uma objetiva de alta potência é usada, e o plano focal posterior da objetiva não é completamente preenchido com luz.
Quando a microscopia de contraste de fase é tentada com um condensador com foco errado, o anel no condensador muitas vezes não irá corresponder ao diâmetro do anel de fase no plano focal posterior da objetiva, e qualquer aumento de contraste é perdido. Problemas na focalização do condensador também podem resultar em microscopia pobre em terra escura, se a imagem do patch stop não ocluir completamente a iluminação direta da objetiva. A próxima parte desta série retorna à objetiva, e considera o comprimento do tubo, e como determinar a distância focal, ampliação, abertura e outros parâmetros de suas objetivas.
Bradbury S. & Evennett P. J. (1996) Técnicas de Contraste em Microscopia de Luz. Editores Científicos Bios. ISBN 1-85996-085-5
Sanderson, J. B. (1994) Contraste em Microscopia de Luz: Uma Visão Geral. Proceedings of the Royal Microscopical Society 29/4:263-270
Sanderson, J. B. (1998) Contrast Enhancement Techniques for Light Microscopy in Cell Biology: A Laboratory Handbook 2nd Edn. Cellis, J. (ed). (1998) Vol 3: 15-33, Academic Press. ISBN (conjunto de 4 volts) 0-12-164725-0; vol 3 somente = 0-12-164728-5
Sanderson, J. B. (2000) The Theory of Contrast Control in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 38:617-627.
Sanderson, J. B. (2002) Practical Control of Contrast in the Microscope, Quekett Journal of Microscopy, 39:275-288.