Después de graduarse en la Southwest Texas State University de San Marcos (Texas), Boothe se incorporó a la compañía de repertorio del Festival de Shakespeare de Oregón, con papeles en Enrique IV, Parte 2 (interpretando a Enrique IV de Inglaterra), Troilo y Crésida, y otros. Su debut en los escenarios de Nueva York fue en la producción de Ricardo III del Lincoln Center de 1974. Cinco años más tarde, debutó en el teatro de Broadway con un papel protagonista en la obra de un solo acto Lone Star, escrita por James McLure.
Boothe llamó la atención nacional por primera vez en 1980, interpretando a Jim Jones en la película de la CBS-TV Guyana Tragedy: La historia de Jim Jones. La interpretación de Boothe del enloquecido líder de la secta recibió elogios de la crítica. En el reportaje de Time sobre la producción, Boothe fue elogiado: «Hay una actuación extraordinaria. Un joven actor llamado Powers Boothe capta todo el carisma y la maldad de ‘Papá’, Jim Jones». Boothe ganó el premio Emmy por su papel, superando a los veteranos Henry Fonda y Jason Robards. Cuando el Sindicato de Actores estaba en huelga en otoño de 1980, fue el único actor que cruzó las líneas de piquete para asistir a las ceremonias, y dijo entonces: «Este puede ser el momento más valiente de mi carrera o el más tonto».
Boothe interpretó a Philip Marlowe en una serie de televisión basada en las historias cortas de Raymond Chandler para la HBO en la década de 1980. Apareció en películas como Southern Comfort, A Breed Apart, Red Dawn, The Emerald Forest, Rapid Fire y Extreme Prejudice, así como en las películas de HBO Into the Homeland y By Dawn’s Early Light. Además, apareció en la película de la CBS-TV de 1990 Family of Spies, en la que interpretó al oficial de la Marina traidor John Walker. Boothe interpretó a Curly Bill Brocius en el exitoso western de 1993 Tombstone, al desleal oficial superior del ejército en Blue Sky (frente a la interpretación de Jessica Lange, ganadora de un Oscar), y al siniestro terrorista principal en Sudden Death. También formó parte de los grandes repartos de las películas de Oliver Stone Nixon (como el Jefe de Estado Mayor Alexander Haig) y U Turn (como el sheriff del pueblo).
En 2001, protagonizó el papel de Flavius Aëtius, el general romano encargado de detener la invasión de los hunos en la miniserie hecha para la televisión Attila. Boothe interpretó un papel destacado como el propietario de un burdel Cy Tolliver en la serie de HBO Deadwood, y el sórdido senador Roark en la película Sin City (2005), así como en su secuela, Sin City: Una dama para matar (2014). Es la voz de uno de los personajes del videojuego Area 51 de 2005 y de Gorilla Grodd, el supervillano telepático hiperinteligente de Justice League y Justice League Unlimited. También puso voz al villano Kane en el videojuego Turok de 2008.
Fue una estrella invitada especial en 24, donde interpretó al vicepresidente Noah Daniels. Volvió en la precuela de la séptima temporada, 24: Redención. Justo después de asumir el papel de presidente en funciones, se ve a Boothe saliendo del Air Force Two con los F-15 de fondo. Boothe interpretó a un piloto de F-15 derribado en Amanecer Rojo. En marzo de 2008, narró un anuncio de campaña en televisión para la campaña presidencial del senador John McCain.
En 2012, Boothe apareció en Los Vengadores, de Joss Whedon, en un papel secreto como un sombrío superior gubernamental de S.H.I.E.L.D. En 2015-16, repitió el papel, ahora con el nombre de Gideon Malick, en la serie de ABC Agents of S.H.I.E.L.D.
Boothe apareció en la miniserie de 2012 Hatfields &Macoys como el juez Valentine «Wall» Hatfield. Boothe también interpretó a Lamar Wyatt en la serie dramática musical de ABC Nashville. Boothe también prestó su voz para Hitman: Absolution, un videojuego de 2012 desarrollado por IO Interactive, poniendo voz al personaje de Benjamin Travis.