Introducción
La depresión es un grave problema de salud incapacitante con alta incidencia en todo el mundo;1 sin embargo, el mecanismo de su aparición y desarrollo sigue sin estar claro. Estudios recientes sugieren que el eje microbiano-intestinal-cerebral puede afectar al estado de ánimo y al comportamiento de las personas de diversas maneras. Al interactuar con el nervio vago, cambiando directamente la función del sistema nervioso central, afectando al sistema nervioso intestinal, cambiando la plasticidad del cerebro,2 activando el sistema inmunitario, e incluso de más formas,3,4 estas bacterias patógenas condicionadas pueden causar la enfermedad. Se han encontrado cada vez más evidencias que llevan a pensar que la asociación entre la microbiota intestinal y la depresión es significativa.
En el caso del modelo de depresión en ratones, se encontró que los cambios de la microbiota intestinal y el fenotipo metabólico fecal se correlacionan con la depresión a través de la secuenciación del ARNr 16S y los métodos de investigación basados en la metabolómica por cromatografía líquida-espectrometría de masas.5 Además, tres estudios han demostrado que los ratones libres de gérmenes mostraban un comportamiento más parecido a la depresión después de que se les trasplantara microbiota intestinal de personas deprimidas.6-8 Estos experimentos con animales sugieren que el trastorno de la microbiota intestinal puede causar depresión. Además, en el proceso patológico del desarrollo de la depresión tampoco se pueden ignorar las crecientes evidencias de una reacción inmune inflamatoria continua de bajo nivel,5,9 ya que la fuente de esta reacción inmune inflamatoria está probablemente relacionada con el desorden de la microbiota intestinal. En primer lugar, las bacterias de Firmicutes en la microbiota intestinal pueden fermentar los carbohidratos en una variedad de ácidos grasos de cadena corta (AGCC),10 y la falta de estos AGCC puede conducir a la disminución de la función de barrera intestinal.11 Entonces, cuando muchos patógenos condicionales y sus metabolitos en el tracto intestinal atraviesan la barrera, y estimulan la respuesta inmunitaria, se forma el «intestino permeable», que puede afectar a la aparición y el desarrollo de la enfermedad.12 Esto puede apoyarse en el estudio de Yu et al, que demostró que había una disminución significativa de Firmicutes en ratones deprimidos.13 Otro estudio también encontró una correlación significativa entre los cambios de comportamiento inducidos por el estrés en ratones y el trastorno de Firmicutes en la microbiota intestinal.14 En pacientes con enfermedad inflamatoria intestinal (EII), la cantidad de Faecalibacterium prausnitzii en Firmicutes es mínima, y la disminución de la proporción de bacterias se asoció con la disminución de la función de protección de la mucosa intestinal.15 Estos estudios sugieren que los Firmicutes, como factor de protección del intestino, merecen una mayor exploración.
Se puede observar que los Firmicutes y los Bacteroidetes siguen siendo dos focos principales en los estudios humanos relacionados con la microbiota intestinal y la depresión. A diferentes niveles, se ha demostrado cierta diferencia en la microbiota intestinal entre los pacientes y el grupo de control sano (HC), pero los resultados de los estudios sobre Firmicutes son inconsistentes. En el estudio de Jiang et al,16 se encontró que había una disminución significativa de Firmicutes. Sin embargo, en otros tres estudios, no hubo ninguna diferencia evidente de Firmicutes a nivel de filo.6 Además, algunas bacterias asociadas a Firmicutes disminuyeron en gran medida a niveles inferiores, mientras que otras mostraron cierto incremento. La incoherencia de estos resultados puede deberse a los siguientes factores 1) El grupo de HC de referencia no era totalmente normal. 2) El estado de salud individual de los pacientes reclutados era diferente. 3) El intervalo de edad de los pacientes variaba en esos estudios. 4) Los efectos del tratamiento relacionado. 5) Las diferencias en la dieta entre los síntomas típicos y los síntomas atípicos de la depresión. Aunque los resultados de varios estudios son inconsistentes, el trastorno de Firmicutes puede seguir considerándose como una de las características de los pacientes con depresión.
Para explorar una correlación más segura entre el trastorno de Firmicutes y la aparición y el desarrollo de la depresión, ajustamos los criterios de inclusión para limitar mejor la posible interferencia de los factores mencionados en la microbiota intestinal y así evitar la inconsistencia aparecida en estudios anteriores. Nuestro objetivo es aclarar los cambios de Firmicutes en pacientes con depresión y sus efectos relacionados.
Materiales y métodos
Participantes
Este estudio fue aprobado por el comité de ética del Sexto Hospital de la Universidad de Pekín y del Hospital de Medicina Tradicional y Occidental de Pekín. La información clínica se recogió en el Hospital de Medicina Tradicional y Occidental de Pekín. Todos los sujetos firmaron su consentimiento informado por escrito antes de participar. La información clínica y la recogida de muestras se llevaron a cabo después de obtener el consentimiento informado de todos los sujetos, y todos los procedimientos se ajustaron a las directrices de la Declaración de Helsinki.
Reclutamos a los sujetos siguiendo unos criterios de inclusión rediseñados con una emendación de los estudios anteriores.6,8,16-18 Se realizaron algunos ajustes de acuerdo con las normas médicas específicas de la región de Pekín. Entre el 30 de marzo y el 30 de junio de 2018, reclutamos a 30 pacientes con depresión, en los que 27 cumplieron los criterios del estudio y formaron el grupo de trastorno depresivo mayor (TDM); luego se seleccionaron 27 sujetos sanos como el grupo de HC según la edad y el sexo del grupo de TDM. Ambos grupos son residentes chinos de la etnia Han que viven en Pekín desde hace mucho tiempo, no tienen hábitos alimentarios especiales y su IMC oscila entre 18 y 30 kg/m2. El grupo de MDD cumplía los criterios diagnósticos de la CIE-10 MDD; se encontraban en el primer episodio y sin tratamiento antidepresivo sistémico. Se excluyeron los episodios depresivos causados por abuso orgánico y de sustancias y aquellos con características atípicas. El grupo de HC fue evaluado por dos médicos de cabecera certificados para excluir cualquier otra enfermedad mental.
Además, al examinar cuidadosamente los enfoques aplicados en investigaciones anteriores,19 también pusimos una limitación más estricta a los criterios de exclusión. Revisamos los datos médicos anteriores proporcionados por los sujetos y no se incluyó en este estudio a ninguno de los siguientes sujetos 1) que padecieran cualquier otra enfermedad crónica que pudiera afectar a la estabilidad de la microbiota intestinal, como hipertensión, diabetes mellitus, síndrome metabólico, inmunodeficiencia, enfermedad autoinmune, cáncer, EII, diarrea en los últimos 3 meses; 2) que se hubieran utilizado fármacos que afectaran a la microbiota intestinal en los últimos 6 meses, incluidos antibióticos, glucocorticoides, citocinas, grandes dosis de probióticos y agentes biológicos, etc; 3) se ha realizado una gastroscopia, una colonoscopia o una comida con bario en el tracto digestivo en los últimos 6 meses; 4) personas que se han sometido a una cirugía gastrointestinal mayor (colecistectomía, apendicectomía y resección del tracto intestinal) en los últimos 5 años; 5) personas con movimiento restringido debido a una enfermedad física o mental importante; 6) personas que han experimentado cambios dietéticos significativos en los últimos 6 meses; y 7) mujeres gestantes.
Recogida de información clínica
Recogimos información general de todos los sujetos mediante cuestionarios. La información general incluye la edad, el sexo, la raza, la altura, el peso, los antecedentes médicos, los antecedentes de drogas, los antecedentes de tabaquismo y los antecedentes de consumo de alcohol.
Amplificación y secuenciación del ARNr 16S
Las muestras fecales de los participantes fueron colocadas en recipientes estériles por ellos mismos y recogidas en el centro fecal por un especialista. Las 54 muestras fecales frescas se almacenaron a -80°C antes de la extracción de ADN. El ADN se extrajo de 200 mg de muestra fecal utilizando el kit de ADN PowerSoil (Missouri Biotechnology Association, Jefferson, MO, USA) y operando según las instrucciones del fabricante. Se amplificó la región V3-V4 del ARNr 16S y se observó con los pares de cebadores universales 341F (5′-GGACTACHVGGTWTCTAAT-3′) y 805R (5′-ACTCCTACGGAGGCAGCAG-3′) mediante KAPA HiFi HotStart ReadyMix (KAPA Biosystems, Inc., Wilmington, MA, USA). Se añadieron códigos de barras únicos de 8 nt a los cebadores en diferentes muestras. La PCR se llevó a cabo en condiciones de ciclado: 95°C durante 5 minutos, 20 ciclos de 98°C durante 20 segundos, 58°C durante 30 segundos, 72°C durante 30 segundos y 72°C durante 5 minutos. Se añadieron 10 pmol de cebadores y 100 ng de plantillas a las reacciones de PCR de 50 μL, luego se realizó la PCR por triplicado y se agruparon los productos de la PCR. Se utilizó el kit de extracción en gel QIAquick (QIAGEN, Hilden, Alemania) para seleccionar los segmentos de ADN del tamaño adecuado. Todos los segmentos de ADN seleccionados se secuenciaron en modo paired-end utilizando Illumina HiSeq2500 en el Instituto de Bioinformática Novogene, Pekín, China.
Análisis estadísticos
Análisis demográfico
Se utilizó el paquete estadístico SPSS 23.0 para Windows para el análisis de datos. Se compararon los datos demográficos y las características clínicas entre los grupos. Las variables continuas se realizaron mediante la prueba t de muestras independientes. El nivel de significación se fijó en 0,05 (dos colas).
Análisis de datos de secuenciación
Las lecturas crudas se desmultiplexaron utilizando seqtk (https://github.com/lh3/seqtk). Las lecturas de extremo emparejado se fusionaron con FLASH y se filtró la calidad con Trimmomatic: se fusionaron los pares con un solapamiento de >15 nt;20,21 las secuencias fusionadas se recortaron cuando la puntuación de calidad media en una ventana de 4 bases era <20, y se eliminaron las secuencias que contenían bases ambiguas o <400 pb. Se agruparon todas las secuencias calificadas y se seleccionaron las unidades taxonómicas operativas (OTU) utilizando el script pick_open_reference_otus.py de QIIME 1.9.1,22 y se eliminaron las quimeras alineando las secuencias con la base de datos de referencia «oro» utilizando UCHIME. Las secuencias de OTU se asignaron a la taxonomía utilizando assign_taxonomy.py de QIIME. Todas las secuencias representativas (OTUs) fueron mapeadas contra la base de datos Greengenes23 usando el algoritmo UCLUST con un 97% de identidad.24 Las secuencias representativas fueron alineadas por mafft,25 y el árbol filogenético fue generado por FastTree usando QIIME.26 Se eliminaron los aislados y las OTU que sólo aparecen en una muestra, y la tabla de OTU se enrareció utilizando QIIME.Los valores de diversidad
ACE, Chao1 y Shannon se calcularon utilizando vegan,27 y las pruebas estadísticas se realizaron utilizando R.28 La diversidad filogenética de Faith se analizó utilizando alpha_diversity.py y compare_alpha_diversity.py de QIIME. Las distancias Unifrac ponderadas y no ponderadas se calcularon utilizando beta_diversity.py de QIIME, y el análisis de coordenadas principales (PCoA) se realizó utilizando R. La prueba de significación de la diversidad filogenética de Faith se realizó utilizando la prueba de permutación de Monte Carlo en QIIME, y todas las demás pruebas de significación se realizaron utilizando la prueba de Wilcoxon en R.
Los biomarcadores taxonómicos de los grupos HC y MDD se analizaron utilizando LEfSe (análisis discriminante lineal Tamaño del Efecto), y los taxones con valor P <0,01 y puntuación LDA >2,0 fueron elegidos como biomarcadores. El perfil funcional del metagenoma se predijo utilizando PICRUSt,29 y las OTU de novo se eliminaron antes de la predicción del perfil funcional de acuerdo con el manual de PICRUSt. Los KOs (KEGG orthology) y las vías predichas se analizaron utilizando STAMP,30 y el valor P <0.01 se utilizó para seleccionar KOs y vías diferenciales entre las muestras de HC y MDD.
Resultados
Datos demográficos y características clínicas de los sujetos
Reclutamos un total de 54 sujetos, incluyendo 27 pacientes con MDD y 27 HC; ambos grupos tenían la misma proporción de hombres y mujeres de 7:20. La edad media del grupo de pacientes era de 48,7±12,8 y la de los HC de 42,3±14,1. Como muestra la tabla, no hubo diferencias significativas en cuanto a la edad, la estatura, el peso y el IMC entre los dos grupos (Tabla 1).
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Tabla 1 Características demográficas y clínicas |
Recogida deOTU
Los pares de lecturas de secuenciación en bruto de las muestras oscilan entre 11.015 y 1.035.838, y la longitud de las lecturas es de 250 pb. Después de fusionar las lecturas del extremo del par, filtrar la calidad y agrupar las UOT, las secuencias disponibles de las muestras están entre 3.505 y 662.238. La tasa de utilización de las lecturas totales es del 52,26%. Tras la selección de OTUs y la asignación de taxonomía, se recogieron 2.888 OTUs de todas las secuencias y se identificaron 183 taxones conocidos.
Diversidad de la microbiota intestinal inferior en pacientes con MDD
Nuestros resultados muestran que los índices de diversidad alfa de los HC son mayores que los de los pacientes con MDD (Figura 1). Los índices de diversidad Chao1 y ACE pueden utilizarse para evaluar la riqueza de especies de las muestras. Estos dos índices son significativamente mayores en los HC que en los MDD (P<0,0008, prueba de Wilcox), lo que indica que hay más especies en las personas sanas. El índice de Shannon puede utilizarse para estimar la uniformidad y la riqueza de especies de la muestra, que es significativamente mayor en las muestras de HC que en las de MDD (P=0,003, prueba de Wilcox), lo que indica que las personas sanas tienen una mayor diversidad de especies. El índice de diversidad filogenética de Faith puede utilizarse para estimar la diversidad filogenética de las especies dentro de una muestra, y este índice también es significativamente mayor en las muestras de HC que en las de MDD (P=0,04, prueba de permutación de Monte Carlo). Todo ello indica que existe una disminución significativa de la diversidad de la microbiota intestinal en las personas con MDD que en las personas con HC. El gráfico PCoA basado en la distancia Unifrac ponderada también muestra que las muestras de MDD y HC son obviamente diferentes en el perfil de la comunidad (Figura 2). Tras la asignación de la taxonomía, la abundancia relativa de Bacteroides y Firmicutes son los dos filos más altos tanto en las muestras de HC como de MDD, que juntos suman un 92% de abundancia relativa en las muestras de HC y un 90% en las de MDD (Figura 3A). Otra diferencia importante entre las muestras HC y MDD es el porcentaje del filo Firmicutes (Figura 3B). La abundancia relativa media de Firmicutes en las muestras HC es del 43,46%, mientras que en las muestras MDD es sólo del 28,72% (P=0,00016, prueba de Wilcox).
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Figura 1 Diversidad alfa de las muestras HC y MDD. |
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Figura 2 Diversidad beta de HC y MDD. |
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Figura 3 Taxones en el nivel de phylum de HC y MDD. |
Los biomarcadores taxonómicos en HC son todos de Firmicutes
En total, hay 13 biomarcadores taxonómicos encontrados con valor P <0.01 (prueba de Kruskal-Wallis) y puntuación LDA (log 10) >2,0, y entre ellos siete están enriquecidos en HC y seis en MDD (Figura 4). Los seis biomarcadores en HC son todos de Firmicutes, incluyendo Lachnospiraceae, Ruminococcaceae, Coprococcus, Blautia, Clostridiaceae, y Dorea. Los seis biomarcadores enriquecidos en MDD son de Proteobacterias (Oxalobacter y Pseudomonas) y Firmicutes (Parvimonas, Bulleidia, Peptostreptococcus y Gemella).1 Esto sugiere que Firmicutes es el filo más importante que se correlaciona con la depresión.
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Figura 4 Biomarcadores taxonómicos en HC y MDD. |
Predicción de perfiles de función
Hay once vías KEGG enriquecidas en MDD (P<0.01, prueba t de Welch), incluyendo la biosíntesis de lipopolisacáridos, la biosíntesis de ubiquinona y otras terpenoides-quinonas, la degradación de glicosaminoglicanos, la biosíntesis de glicoesfingolípidos, la degradación de tolueno, los antígenos celulares, la digestión y absorción de proteínas, la biosíntesis de hormonas esteroides y el metabolismo del ácido lipoico. Seis vías están enriquecidas en la HC, incluyendo la esporulación, las proteínas de la motilidad bacteriana, la quimiotaxis bacteriana, la degradación del nitrotolueno, la germinación, la síntesis y la degradación de los cuerpos cetónicos (Figura 5). Estos cambios en la microbiota en los pacientes con MDD y los efectos en los metabolitos podrían explorarse más en futuros estudios.
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Figura 5 Vías KEGG diferenciales predichas en HC y MDD. |
Discusión
Los firmicutes representan alrededor del 40%-65% de la microbiota de colon o fecal. Según los resultados de la secuenciación del ARNr 16S anterior, la flora de abundancia dominante incluye tres clústeres principales de Clostridium (IV, IX y XIV), mientras que otros clústeres tienen una abundancia menor.10 En nuestro estudio, se muestra que el contenido global de Firmicutes en los pacientes con depresión fue significativamente menor que el del grupo sano; esto coincide con los hallazgos de Jiang et al.16 A nivel de géneros, los géneros de Firmicutes significativamente reducidos cayeron principalmente en tres familias, que son las Faecalibacterium de las Ruminococcaceae y las Dorea, mientras que Coprococcus de las Lachnospiraceae tienen la diferencia más significativa (P<0,001). Estos géneros pertenecen al clúster IV y XIVa de Clostridium, respectivamente, y pueden metabolizar varios sustratos de hidratos de carbono para formar diversos AGCS, como acetato, butirato y lactato.10 La reducción de estas bacterias relacionadas con la fermentación conduce a una disminución de la producción de AGCS, lo que a su vez provoca una disfunción de la barrera intestinal.11 Esta función de barrera natural se debilita, se exponen múltiples sustancias antigénicas y la debilidad del tracto intestinal se convierte en fuente de inflamación.
Estudios anteriores destacaron que los AGCS producidos en el intestino desempeñan un papel importante en la mejora de las enfermedades inflamatorias crónicas y en la promoción de las células epiteliales del colon. Se ha informado de que los AGCC pueden inhibir la producción de citoquinas proinflamatorias, aumentar la expresión de IL-10, activar las células T reguladoras (Tregs) y aliviar la inflamación colónica.31,32 Los AGCC incluyen principalmente acetato, propionato y ácido butírico, que tienen efectos significativos sobre la proliferación, la diferenciación y el metabolismo de las células epiteliales intestinales. Entre ellos, el butirato no sólo puede proporcionar energía al epitelio largo, sino también reforzar la barrera de defensa del colon. Además, el ácido butírico también puede desempeñar un papel en la inhibición del ciclo celular inmunorregulador, la inducción de la muerte celular programada y la diferenciación celular en varios tipos de células. Pruebas recientes sugieren que el butirato y el propionato son claves para la regulación de la producción de Foxp3+ de las Tregs, mientras que las Tregs desempeñan un papel importante en la supresión de las respuestas inflamatorias.33 Dado que la mayoría de las bacterias que producen ácido butírico pertenecen a los Firmicutes,11 con la disminución de los Firmicutes, estos factores de protección se debilitan, y el cuerpo se expone aún más al riesgo de inflamación.
Varios estudios han indicado que las citocinas y la inflamación están estrechamente relacionadas con los síntomas depresivos en pacientes con depresión. Se ha sugerido que la depresión puede considerarse un grupo de síntomas causados por la inflamación periférica y una respuesta a la inflamación.34,35 Un metaanálisis sugiere que la concentración de IL-6 y TNF-α en la sangre está significativamente elevada en la depresión sin ninguna enfermedad física.36 Un gran número de estudios longitudinales han demostrado que las citocinas exógenas pueden agravar los síntomas depresivos.37-41 Del mismo modo, la inyección de endotoxina de lipopolisacárido o de una vacuna relacionada puede aumentar tanto las concentraciones de citoquinas proinflamatorias como los síntomas depresivos.42-44 En el estudio con ratones de Zhang et al, se encontró que había una disminución significativa de Firmicutes en el modelo de estrés de derrota social, mientras que el cambio de proteobacterias no era significativo. También descubrieron que la inyección intravenosa de MR16-1 induce efectos antidepresivos al normalizar la composición alterada del microbioma intestinal.45 Esto coincide con nuestra conclusión.
Además, algunos procesos inmunitarios mediados por células también pueden estar implicados en el desarrollo de la depresión.46 Dos meta-análisis han indicado que existen múltiples activaciones de las vías inmunitarias celulares en los pacientes con depresión.36,47 Aunque actualmente no existen pruebas directas de que la inflamación de bajo grado en los pacientes depresivos provenga del intestino, cada vez hay más pruebas de que la microbiota intestinal es importante para causar este proceso inflamatorio. Aunque algunos estudios preclínicos y clínicos han confirmado los efectos positivos de la suplementación con probióticos sobre los síntomas depresivos, un metaanálisis demostró que la suplementación con probióticos tiene un efecto global insignificante sobre el estado de ánimo.48 Por lo tanto, todavía es necesario aclarar más los cambios de la microbiota intestinal en la depresión, lo que podría ayudar a la suplementación dirigida a lograr un mejor efecto.
En conclusión, nuestro estudio encontró que hay un trastorno significativo de la microbiota intestinal en pacientes con depresión, en la que los Firmicutes disminuyeron significativamente. Los defectos de los Firmicutes pueden conducir a la depresión en SCFA, que puede ser la base fisiológica de la inflamación de bajo nivel de la depresión. En el futuro, podemos seguir explorando el papel de Firmicutes en la depresión a través del método de la multiómica.
Limitación
Este estudio todavía tiene algunas limitaciones. En primer lugar, el tamaño de la muestra que utilizamos fue comparativamente pequeño debido al límite financiero. En segundo lugar, aunque los resultados de este estudio apoyan que la microbiota intestinal desempeña un papel en el desarrollo de la depresión, actualmente no podemos investigar cómo cambió exactamente la microbiota intestinal junto con este proceso. En futuros estudios, los cambios de la microbiota intestinal deberían observarse más a fondo en los grupos de alto riesgo a lo largo de su posible desarrollo de los síntomas. En tercer lugar, en este estudio faltan indicadores inflamatorios relevantes. Por último, aunque seleccionamos cuidadosamente a los sujetos con el fin de reducir la influencia de los factores relacionados con la microbiota intestinal, algunos factores de confusión, como la dieta, todavía necesitan un mayor control o evaluaciones detalladas. Además, los síntomas atípicos de la depresión, como la avidez y la somnolencia, también podrían tener un impacto potencial en la microbiota intestinal, lo que requiere una clasificación más detallada de la depresión en futuras investigaciones.
Agradecimientos
Agradecemos a todos los sujetos que participaron en este estudio. Todos los costes de este estudio son autofinanciados.
Divulgación
Los autores declaran no tener conflictos de intereses en este trabajo.
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