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Árboles de unión de vecinos para las secuencias ITS y sodA. Los aislamientos clínicos se indican con el número de VMC y la asignación final de especies. Los colores de relleno corresponden a la enfermedad subyacente del paciente, y los contornos rojos indican las cepas de referencia. La escala indica el número de sustituciones de bases por sitio, con distancias determinadas mediante el método de máxima probabilidad compuesta (21). Los valores de Bootstrap que fueron iguales o superiores al 50% a partir de 2.000 réplicas se indican en texto azul junto a las ramas. *Se ha sugerido anteriormente que el análisis de ITS por sí solo es suficiente para la identificación de especies de estreptococos orales, incluida la de las especies estrechamente relacionadas S. mitis y S. oralis. Se sugirió que las deleciones monobásicas conservadas en dos sitios y una longitud total del ITS de 246 pb eran características de S. oralis, mientras que se propuso que S. mitis carecía de las deleciones y poseía un ITS de 248 a 249 pb (2, 3). En nuestro estudio, encontramos aislados de ambas especies que poseían ambas deleciones o ninguna, junto con longitudes de ITS que se solapaban. Así pues, los aislados de S. oralis y S. mitis no pudieron distinguirse de forma fiable según estos criterios. Otro estudio ha sugerido que el análisis de la secuencia ITS, aunque no es suficiente para distinguir S. oralis y S. mitis, sí lo es para la identificación de muchas otras especies de estreptococos orales, incluidas las pertenecientes al grupo anginosus (18). Sin embargo, encontramos un aislado de la especie del grupo anginosus S. intermedius (VMC38) que no pudo ser clasificado por el ITS (véase la Tabla S1 en el material suplementario).

Un gran número de aislados, especialmente de S. mitis y Streptococcus constellatus, también poseían secuencias idénticas, lo que impedía el análisis filogenético. También se obtuvieron secuencias idénticas de cinco pares de aislados procedentes de los mismos pacientes (datos no mostrados).

Debido a que el análisis de ITS no era suficiente para nuestros propósitos, secuenciamos un segundo objetivo común: el gen sodA, que codifica la superóxido dismutasa dependiente de manganeso (1, 5, 10, 12, 14, 19, 27). Esto permitió excluir varios aislamientos. Las parejas de cepas mencionadas anteriormente como originarias de los mismos sujetos y con idénticas secuencias ITS también poseían idénticas secuencias sodA, lo que confirmó que los aislados eran idénticos, y se descartó un aislado de cada pareja. Se descartaron dos aislados debido a un aparente error en la manipulación de la cepa, y otro no se conservó porque las secuencias ITS y sodA indicaban que se trataba de una cepa de Enterococcus faecalis. En la Fig. 1 se muestra un árbol filogenético derivado de los aislados restantes.

El alineamiento del sodA fue superior al del ITS para el análisis filogenético. Los únicos aislados con secuencias sodA idénticas fueron dos cepas de S. mitis y dos cepas de Streptococcus vestibularis. El alineamiento de sodA también fue más útil para la determinación de las especies. Todas las cepas de referencia estaban bien separadas entre sí en el árbol filogenético. El resultado fue sólo cuatro asignaciones de especies ambiguas para sodA, en comparación con 15 para el ITS (véase la Tabla S1 en el material suplementario). En los casos en los que la designación de una sola especie era coherente con las secuencias ITS y sodA, se utilizó esa designación. Sólo 3 de los 58 aislados clínicos finales no pudieron ser identificados con seguridad utilizando este método. Los aislados VMC1 y VMC43 produjeron secuencias ITS demasiado cortas para ser informativas, a pesar de los repetidos intentos de secuenciación, y VMC58 fue identificado de forma inconsistente por las secuencias ITS y sodA (Fig. 1; Tabla S1). Confirmamos la identidad de las especies de estos aislados utilizando una base de datos recientemente publicada que contiene las secuencias de siete genes de mantenimiento de 420 cepas estreptocócicas bien caracterizadas, incluyendo sodA, pfl y pyk (1). Se determinaron las secuencias de los genes pfl y/o pyk de todas las cepas dudosas y se alinearon con las secuencias de la base de datos eMLSA.net (http://www.emlsa.net/), al igual que las secuencias de sodA existentes. En todos los casos, las asignaciones de las especies pfl y pyk coincidieron con las de sodA. Además, el alineamiento de sodA indicó que la secuencia de VMC58, aunque divergente de la cepa tipo, se encontraba dentro de un grupo de 13 aislados de Streptococcus infantis en la base de datos (datos no mostrados). La identificación consensuada de las especies de todos los aislados incluidos en el estudio se indica en la Fig. 1 y en las Tablas S1 y S2 del material suplementario.

Aunque estos resultados sugieren que el análisis de sodA por sí solo es suficiente para identificar la mayoría de las cepas, recomendamos la inclusión de al menos un gen de mantenimiento de proteínas adicional para todas las cepas. Muchos estreptococos orales son naturalmente competentes, y se ha informado de casos de adquisición de genes de mantenimiento de la casa extraños, incluido el sodA (1, 12). Esto no fue evidente en nuestro estudio, pero hubo casos de secuencias quiméricas ITS (VMC38 y VMC50) y sodA (VMC33). Dos publicaciones recientes han ido más allá, sugiriendo cada una la secuenciación de un conjunto diferente de siete genes de mantenimiento de la casa para la tipificación de secuencias multilocus (7) o el análisis de secuencias multilocus (1). Estos enfoques se basan en el análisis de un mayor número de genes para proporcionar una mayor resolución y minimizar los efectos de los genes quiméricos o extraños ocasionales (1, 7). Estos esquemas también permiten realizar análisis filogenéticos más sofisticados que los que son posibles con sólo dos o tres genes. Sin embargo, ocasionalmente experimentamos dificultades en la amplificación y secuenciación de pfl y pyk y poco éxito con dos de los otros genes recomendados, map y ppaC (1). Otro estudio reciente informó de dificultades similares (27). Así pues, la elección de genes adicionales puede requerir pruebas empíricas, pero los empleados en los análisis de siete genes deberían explorarse en primer lugar, ya que se dispone de grandes colecciones de secuencias de cepas bien caracterizadas para su comparación (1, 7).

Hasta donde sabemos, éste es sólo el segundo informe de un aislado de hemocultivo de Streptococcus australis (12) o S. infantis (30). La única otra asociación de esta última especie con alguna enfermedad procede de dos informes sobre su aislamiento en el esputo de adultos con fibrosis quística (17, 26). Por lo tanto, es interesante que un adulto con fibrosis quística fuera la fuente de nuestro aislado de S. infantis, VMC58 (véase la Tabla S2 en el material suplementario).

Los datos de susceptibilidad a los antibióticos se incluyen en la Tabla S2 y coinciden en gran medida con los estudios anteriores (8). La tabla S2 también proporciona datos clínicos y demográficos de los pacientes fuente, clasificándolos en función de la enfermedad principal subyacente: enfermedad médica, neoplasia, EI o cirugía/trauma. Todos los sujetos con EI fueron diagnosticados clínicamente, y todos menos el caso VMC56 (Tabla S2) fueron clasificados como «EI definitiva» según los criterios de Duke modificados (16). La única excepción tenía antecedentes de EI previa y uso de drogas intravenosas (UDI), lo que junto con los hemocultivos positivos daría lugar a la categorización como «posible EI». También se examinaron los datos sobre las posibles fuentes de infección, como las vías centrales, la endoscopia gastrointestinal, la mucositis oral, las afecciones dentales y el consumo de drogas intravenosas. Se encontró IVDU en 9 de los 13 pacientes con EI y sólo en otro paciente del estudio (Tabla S2). Esta diferencia fue estadísticamente significativa (P < 0,0001; prueba exacta de Fisher). Así pues, aunque este estudio se centró en las especies orales, la UDI fue un factor de riesgo abrumador.

Nuestro análisis filogenético no descubrió asociaciones estadísticamente significativas entre ninguna especie o tipo clonal en particular y la enfermedad subyacente u otros parámetros clínicos, incluidos el recuento de glóbulos blancos, la temperatura más alta, el tamaño de la vegetación, la válvula afectada o la muerte del paciente. Un estudio anterior contenía suficiente información para identificar las especies aisladas en pacientes neutropénicos (12). Nuestros resultados fueron similares, en el sentido de que 11 de los 12 aislados en ese estudio y 9 de los 10 en el nuestro (Tabla S2) eran S. mitis o el estrechamente relacionado S. oralis. En nuestro estudio, estas dos especies, en conjunto, tenían una probabilidad significativamente mayor que las 12 especies restantes combinadas de ser aisladas de pacientes neutropénicos (P = 0,004; prueba exacta de Fisher). Esto puede reflejar la prevalencia de estas especies en la cavidad oral. Sin embargo, es interesante que esta tendencia no se haya trasladado a la EI. Combinando nuestros datos con los del mismo estudio (12) para la neutropenia y la EI, S. oralis y S. mitis se aislaron en 20 de 22 casos de neutropenia y sólo en 15 de 27 casos de EI, una diferencia que fue estadísticamente significativa (P = 0,01; prueba exacta de Fisher). Al igual que en estudios anteriores (11, 12, 30), el número de muestras limitó nuestra capacidad para evaluar con confianza otras posibles asociaciones entre especies y enfermedades o características clínicas concretas. Sin embargo, al emparejar la identificación definitiva de las especies con las características clínicas y demográficas de cada paciente de origen (Tabla S2), hemos intentado que nuestros resultados sean adecuados para el meta-análisis u otros estudios que utilicen datos combinados.