En la Figura 2(a) se ilustra el perfil de emisión de fluorescencia utilizando el bloque de filtros DAPI-FITC y un cultivo de células de fibroblastos de piel de ciervo de la India teñidas con Alexa Fluor 488 conjugado con faloidina, que se une a la red de actina filamentosa intracelular. El máximo de absorción de luz visible del Alexa Fluor 488 es de 495 nanómetros y el máximo de emisión se produce a 519 nanómetros en la región verde del espectro. Además, la muestra se tiñó simultáneamente con DAPI (dirigido al ADN del núcleo celular; excitación a 358 nanómetros y emisión a 461 nanómetros) y MitoTracker Red CMXRos (dirigido a las mitocondrias; emisión roja). Obsérvese la ausencia de señal del fluoróforo rojo (MitoTracker), pero la presencia de fluorescencia verde brillante exhibida por los filamentos de actina y la señal azul de intensidad ligeramente inferior de DAPI en el núcleo celular.
En la Figura 2(b) se presenta una sección delgada de intestino de ratón teñida con aglutinina de germen de trigo Alexa Fluor 350, una lectina fluorescente azul que es específica de la mucosa de las células caliciformes. Además, la muestra se tiñó simultáneamente con faloidina Alexa Fluor 568 (actina filamentosa; emisión de 600 nanómetros) y SYTOX Green (núcleos; excitación de 504 nanómetros y emisión de 523 nanómetros). Obsérvese el bajo nivel de señal del fluoróforo azul (Alexa Fluor 350), pero la fluorescencia verde brillante de los núcleos en la muestra de tejido debido a la fluorescencia del SYTOX Green. Esta combinación de filtro de excitación dual elimina eficazmente la señal de la sonda roja (Alexa Fluor 568).
La figura 2(c) demuestra la intensidad de emisión de fluorescencia de un cultivo de células epiteliales de rata canguro (PtK2) que fueron marcadas por inmunofluorescencia con anticuerpos monoclonales de ratón primarios anti-tubulina alfa, seguidos de fragmentos Fab de cabra anti-ratón conjugados con Alexa Fluor 488. Además, la muestra se marcó con Hoechst 33258, que se une selectivamente al ADN del núcleo celular, y MitoTracker Red CMXRos (dirigido a las mitocondrias; fluorescencia roja). Obsérvese la prominente tinción verde de la red intracelular de microtúbulos que se extiende por todo el citoplasma, y la emisión azul del Hoechst 33258 unido al ADN en el núcleo. La célula en la parte inferior de la imagen parece estar experimentando mitosis en el estado de prometafase o metafase.
Células de ratón suizo (línea 3T3) marcadas de forma inmunofluorescente con anticuerpos monoclonales primarios anti citocromo oxidasa de ratón seguidos de fragmentos Fab de cabra anti ratón conjugados con Alexa Fluor 568 se ilustran en la Figura 2(d). La muestra también se marcó con varias sondas adicionales, incluida la lectina Helix pomatia agglutinin (HPA) conjugada con Alexa Fluor 488 (emisión verde), que se une selectivamente a las glicoproteínas del aparato de Golgi en esta línea celular. Los filamentos de actina del citoesqueleto se tiñeron con Alexa Fluor 680 (excitación roja; emisión en el infrarrojo cercano) y el ADN nuclear se marcó con DAPI (emisión azul). Obsérvese la prominente tinción verde del aparato de Golgi y la intensidad de fluorescencia azul observada en los núcleos.
La emisión de fluorescencia de una sección delgada de riñón de ratón teñida con múltiples (3) fluoróforos se presenta en la Figura 2(e). Los núcleos de la sección de tejido se marcaron con la sonda de ácido nucleico DAPI, que tiene un máximo de excitación a 358 nanómetros y un máximo de emisión a 461 nanómetros cuando se une al ADN en cultivos celulares y secciones de tejido. Además, la sección del criostato también se tiñó simultáneamente con Alexa Fluor 488 aglutinina de germen de trigo (glomérulos y túbulos contorneados) y Alexa Fluor 568 faloidina (actina filamentosa y el borde en cepillo). Obsérvese la presencia de señal de las sondas azul (DAPI) y verde (Alexa Fluor 488), pero la ausencia de fluorescencia naranja-roja debida a los conjugados de Alexa Fluor 568 en las redes de actina y del borde en cepillo.
La emisión de autofluorescencia de una sección fina de grano de maíz (Zea mays) se demuestra en la Figura 2(f). La autofluorescencia endógena en los tejidos vegetales surge de una variedad de biomoléculas, incluyendo la clorofila, el caroteno y la xantofila. En las regiones de excitación ultravioleta y azul, la clorofila tiene una banda de absorción con un alto coeficiente de extinción y produce una cantidad significativa de fluorescencia cuando se excita con longitudes de onda entre 350 y 500 nanómetros. Para el tejido del grano de maíz ilustrado anteriormente, nótese la presencia de intensidad de emisión de autofluorescencia en las regiones espectrales azul y verde, que es característica de la combinación de filtros de fluorescencia DAPI-FITC de Nikon.