Abstract
Con una separación cada vez más mejorada de las muestras complejas y la detección de las capacidades de material desconocido, la cromatografía líquida acoplada a la espectrometría de masas (LC-MS) se ha utilizado ampliamente en la investigación de la medicina tradicional china (TCM). Este artículo describe los principios de la cromatografía líquida (CL) y la espectrometría de masas (EM), así como sus ventajas y desventajas en el análisis cualitativo y cuantitativo de la MTC. Recuperamos literatura de investigación sobre la aplicación de la LC-MS en la MTC publicada durante los últimos cinco años en el país y en el extranjero. Para orientar mejor el análisis de la MTC, esta revisión se centra principalmente en la categoría de aplicaciones de la LC-MS, la frecuencia con la que se utilizan los diferentes tipos de LC-MS, y la capacidad cualitativa y cuantitativa de varios LC-MS en el estudio de la MTC.
1. Introducción
Miles de años de acumulación de experiencia sobre la vida y la enfermedad hecha por nuestros antepasados finalmente se tradujo en una farmacia moderna. Las hierbas chinas, con ingredientes complejos y variados, suelen ponerse en práctica por prescripción, siguiendo las reglas de monarca, ministro, asistente y guía. Cuando se aplican, la cantidad de hierbas individuales y las formulaciones farmacéuticas pueden variar, lo que puede provocar cambios en la interacción entre los medicamentos y el principio activo. En los distintos lugares de aplicación de los fármacos, habrá diferencias en los ingredientes. Debido a la complejidad de la composición química de la MTC, las diferentes composiciones químicas también pueden reaccionar entre sí. Aunque la aplicación práctica ha demostrado la eficacia de la MTC, todavía es difícil explicar los ingredientes activos específicos de los medicamentos de la MTC en la ciencia moderna. En los últimos años, el metabolismo in vivo de un compuesto y su mecanismo de acción se han convertido en un tema candente de investigación de la medicina china. Pero sus características, como la composición compleja, el mecanismo de acción multiobjetivo y multimodal, y el papel de los ingredientes, da a la investigación de la MTC un cierto grado de dificultad.
LC-MS integra plenamente la alta capacidad de separación de la muestra de LC para muestras complejas y la fuerte capacidad cualitativa de MS . Debido a su alta sensibilidad y selectividad, la técnica LC-MS ha sido ampliamente utilizada en la investigación de la MTC.
2. LC
La cromatografía separa la mezcla utilizando las diferencias del coeficiente de distribución entre las dos fases (móvil y estacionaria). Según el estado de la fase móvil, la cromatografía puede dividirse en cromatografía de gases, cromatografía de líquidos y cromatografía de fluidos supercríticos, mientras que, según las formas geométricas de la fase estacionaria, la cromatografía puede dividirse en cromatografía en columna, cromatografía en papel y cromatografía en capa fina. El método de CL más utilizado es la cromatografía en columna, que considera el líquido como fase móvil. La cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) se modifica sobre la base de la cromatografía líquida en columna clásica.
La aplicación de la CL se divide en dos categorías. Una de ellas es cualitativa o cuantitativa para una composición particular. La cualificación se gestiona según la consistencia entre la muestra y el componente objetivo en el tiempo de pico . La cuantificación se realiza según la curva estándar generada tras la inyección de estándares a diferentes niveles de concentración. La otra es una huella digital que se refiere a la noción de que, después de que la muestra de la huella digital se ha dispuesto de alguna manera, podemos obtener cromatograma o espectrograma etiquetado características químicas mediante el uso de ciertos métodos de análisis.
LC tiene una gran ventaja en la capacidad de separar muestras complejas, por lo que es la opción más eficaz cuando se aplica para separar mezclas, pero no es adecuado para obtener información estructural del material . La cualificación terminada por el contraste entre las posiciones de los picos de los compuestos desconocidos y los estándares no está disponible para el seguimiento de los compuestos desconocidos.
3. EM
La espectrometría de masas se utiliza ampliamente en el campo de la investigación de la MTC debido a su alta selectividad, alta sensibilidad y capacidad de proporcionar información que incluye la masa molecular relativa y las características estructurales. La EM completa la cualificación mediante la masa molecular y la información estructural pertinente y completa la cuantificación mediante las relaciones del pico y el contenido del compuesto que el pico representa. La ionización a presión atmosférica (API) de la EM cuenta con la ionización por electrospray (ESI) y la ionización química a presión atmosférica (APCI) . Para muchos tipos de compuestos, la ESI tiene una alta sensibilidad. En comparación con la ESI, la APCI es adecuada para los compuestos menos polares y el análisis de compuestos volátiles. Dependiendo de las diferencias entre los analizadores de masas utilizados, la EM común concluye el espectro de masas cuadrupolar (Q-MS), el espectro de masas de tiempo de vuelo (TOF-MS) y la espectrometría de masas con trampa de iones (IT-MS) .
La espectrometría de masas en tándem se refiere a dos o más EM que trabajan juntos. La espectrometría de masas en tándem más utilizada es la espectrometría de masas de triple cuadrupolo (QQQ-MS). Para utilizar el cuadrupolo para llevar a cabo la espectrometría de masas multietapa, se colocan secuencialmente tres cuadrupolos, lo que constituye el triple cuadrupolo . Otro tipo de espectrometría de masas en tándem, como la espectrometría de masas de tiempo de vuelo cuadrupolar (Q-TOF-MS) y la espectrometría de masas en tándem de trampa de iones cuadrupolar (Q-IT-MS), también consiste en una variedad de series de analizadores de calidad . La serie de tiempo de la trampa de iones puede lograr escaneos de MS de múltiples etapas secuencialmente en diferentes momentos, por lo que este estudio categorizó IT-MS como espectrómetro de masas en tándem.
La espectrometría de masas en tándem puede inducir fragmentos de iones moleculares generados por la EM de primera etapa, según la cual podemos inferir la relación entre el hijo y el padre, obtener información estructural de la molécula y luego sugerir la estructura del compuesto, y realizar el análisis de calidad para compuestos conocidos y desconocidos con mayor precisión.
Aunque la EM puede proporcionar información estructural de un material, requiere una mayor pureza para la muestra. En la investigación de la MTC, se utiliza generalmente en combinación con la LC.
4. LC-MS
La técnica LC-MS, que utiliza la LC como sistema de separación y la MS como sistema de detección, consigue finalmente el espectro. Cuando la LC y la MS trabajan juntas, pueden llevar a cabo la MS de múltiples etapas para especular la estructura del compuesto, terminando así el análisis cualitativo y cuantitativo con mayor precisión.
Recuperando los artículos sobre LC-MS en la aplicación de las literaturas de investigación de la MTC publicadas durante los últimos cinco años en el país y en el extranjero, encontramos que podrían separarse en dos categorías, es decir, LC-Q-MS y LC-MS/MS. Con el fin de analizar las diferencias y las ventajas y desventajas de cada método, los artículos se clasificaron según la diferencia de la espectrometría de masas en tándem.
4.1. LC-Q-MS
LC-Q-MS puede utilizarse para realizar análisis cualitativos y cuantitativos de los componentes estándar, como se muestra en la Tabla 1. Al realizar el análisis cualitativo, podemos obtener información estructural a través de la exploración de iones positivos o negativos . También podemos aclarar a qué tipo de sustancia pertenece la estructura química comparándola con las literaturas estándar . El LC-Q-MS cuantifica los compuestos basándose en la selección de iones específicos para su monitorización . En ausencia de estándares, LC-Q-MS puede llevar a cabo el análisis cualitativo para la sustancia utilizando fuertes características cualitativas de la espectrometría de masas .
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LC-Q-MS puede analizar sustancias cualitativamente, pero algunos isómeros o sustancias de peso molecular idéntico necesitan ser explorados más a fondo, cuyas estructuras requieren ser identificadas más a fondo por referencia a la espectrometría de masas multietapa. Además, una cualificación inexacta conduce a un sesgo de la cuantificación.
4.2. LC-MS/MS
4.2.1. LC-IT-MS
IT-MS capta diferentes rangos de calidad de iones haciendo uso de diferentes tamaños de voltaje de RF aplicados a los electrodos de anillo. Tiene una alta sensibilidad, y un solo IT-MS puede lograr funciones de espectrometría de masas multinivel.
IT-MS puede realizar escaneos de MS de múltiples etapas en diferentes órdenes cronológicos, proporcionando fragmentación de MSn de ingredientes; por lo tanto, es adecuado para la materia cualitativa, proporcionando información estructural para la identificación de la composición desconocida, como se muestra en la Tabla 2. En el estudio de la MTC, la LC-IT-MS se utiliza comúnmente en la composición cualitativa.
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4.2.2. LC-QQQ-MS
Triple cuadrupolo significa que tres cuadrupolos están ordenados. Cada cuadrupolo tiene una función independiente. Los modos de escaneo del triple cuadrupolo incluyen el modo de escaneo completo, el modo de escaneo de iones producto, el modo de escaneo de iones padre, el modo de escaneo de pérdida neutra, el modo de escaneo de iones seleccionados y el modo de escaneo de monitoreo de reacciones múltiples.
El LC-QQQ-MS se utiliza principalmente para la cuantificación , como se muestra en la Tabla 3. Algunos estudios se utilizan para la cualificación . Comparado con LC-Q-MS, LC-QQQ-MS puede seleccionar iones particulares para colisionar y analizar los fragmentos después de la colisión. La LC-QQ-MS puede detectar el ion padre y el ion hijo al mismo tiempo, por lo que es precisa, sensible y completa. La LC-QQQ-MS puede aplicarse a un rango más amplio. En comparación con otras espectrometrías de masas en tándem, la de triple cuadrupolo tiene la mejor reproducibilidad cuantitativa. LC-QQQ-MS es el método cuantitativo de sustancias más conocido.
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4.2.3. LC-Q-TOF-MS
La LC-Q-TOF-MS se utiliza generalmente para la cualificación. Tiene una mayor sensibilidad de detección y resolución de masa. La LC-Q-TOF-MS puede medir con precisión la masa.
La LC-Q-TOF-MS se utiliza principalmente para el análisis cualitativo de materiales, como se muestra en la Tabla 4. En comparación con otras espectrometrías de masas en tándem, tiene ventajas en cuanto a sensibilidad de detección, precisión de masa y resolución. La alta resolución y la precisión de la masa dan al LC-Q-TOF-MS una mejor capacidad cualitativa para los iones de fragmentos. También es más persuasivo a la hora de distinguir la estructura de los iones y los isómeros además de analizar estructuras desconocidas en este método .
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5. Conclusiones
En comparación con LC-MS y LC-MS/MS, la investigación de LC-MS/MS se lleva a cabo relativamente más, que tiene una mayor precisión de análisis cualitativo para compuestos conocidos y desconocidos. LC-IT-MS, debido a su capacidad de múltiples niveles de espectrometría de masas, tiene un mejor rendimiento cuando se evalúa una estructura de composición desconocida. La LC-Q-IT-MS tiene una mejor calidad de resolución que la LC-IT-MS. En comparación con los otros tres tipos de LC-MS/MS, la LC-QQQ-MS se aplica más a menudo para la investigación, con una mejor capacidad cuantitativa que las demás. Su capacidad cualitativa es buena, pero aún no tan buena como la LC-Q-TOF-MS. La LC-Q-TOF-MS se utiliza principalmente para el análisis cualitativo de la materia. Algunas de sus capacidades son relativamente excelentes, como la sensibilidad para la detección, la precisión de la masa y la resolución.
Los métodos cualitativos son diferentes entre los diferentes métodos de LC-MS, mientras que los métodos cuantitativos son básicamente los mismos, porque todos los métodos cuantitativos requieren estándares con diferentes concentraciones. Los métodos cuantitativos suelen dividirse en dos tipos diferentes: el método de estándar externo y el método de estándar interno. El método del estándar externo significa que, para llevar a cabo el análisis cuantitativo, se genera primero una curva estándar cuyo eje horizontal representa las concentraciones y el eje vertical representa el área del pico de color del espectro. Luego, según el área del pico, se puede realizar el análisis cualitativo. El método del estándar interno significa que el estándar interno con concentración conocida se añade a las soluciones de la muestra y de la sustancia de referencia híbrida en primer lugar; a continuación, se genera una curva estándar cuyo eje horizontal representa la relación entre la concentración de la muestra de referencia y la concentración de la muestra del estándar interno y el eje vertical representa la relación entre el área del pico del estándar y el área del pico del estándar interno. Por último, se inyecta la muestra de patrón interno. De acuerdo con el área de pico de los indicadores de prueba y el estándar interno, se puede realizar el análisis cualitativo.
En la investigación de la MTC, se concluye que la LC-Q-TOF-MS es una mejor opción en el análisis cualitativo mientras que la LC-QQQ-MS resulta ser mejor para el análisis cuantitativo. El análisis cuantitativo se realiza utilizando un estándar específico con una concentración específica. El análisis cualitativo puede medir la estructura de algunos ingredientes desconocidos y especular sus atribuciones según la información proporcionada por las literaturas de investigación existentes y la base de datos. La validación del estándar es la más precisa para el material cualitativo. Debido a la compleja composición y a las capacidades desconocidas de la MTC, los métodos de investigación no pueden satisfacer relativamente la necesidad todavía. Todavía son necesarias más investigaciones y exploraciones.
Intereses en competencia
Todos los autores declaran que no tienen intereses en competencia.
Agradecimientos
Este trabajo está apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (nº 81273925).