dNTP significa nucleótido trifosfato de desoxirribosa empleado en la PCR para expandir la cadena de ADN en crecimiento. dATP, dTTP, dGTP y dTTP son cuatro dNTPs comunes utilizados en la PCR.
La función de los dNTPs en la PCR es expandir la cadena de ADN en crecimiento con la ayuda de la Taq ADN polimerasa. Se une a la cadena de ADN complementaria mediante enlaces de hidrógeno.
La PCR es una técnica in vitro de síntesis de ADN. El propósito de realizar la PCR es generar múltiples copias de fragmentos de ADN de nuestro interés para visualizarlo bajo la electroforesis en gel.
El objetivo de la PCR es realizar millones de copias de ADN para diversas aplicaciones posteriores como la secuenciación de ADN o el microarray de ADN.
La reacción en cadena de la polimerasa es la herramienta inigualable utilizada en la investigación genética molecular desde su descubrimiento. Los ingredientes de la PCR son una plantilla de ADN, cebadores, tampón, Taq ADN polimerasa y dNTPs. Para entender el mecanismo de la PCR debemos aprender la importancia de cada ingrediente utilizado en ella,
En este artículo, estamos discutiendo uno de los ingredientes clave de la PCR que son los dNTPs. También veremos su estructura y por qué es tan importante.
Además, también hablaremos del mecanismo de interacción de los dNTPs y la Taq ADN polimerasa y su funcionamiento en la hebra de ADN en crecimiento.
Además, hablaremos del mecanismo de cómo los dNTPs y la ADN polimerasa interactúan y ayudan a crecer la hebra de ADN.
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Temas clave:
¿Qué son los dNTPs?
Los dNTPs son los nucleótidos artificiales que se utilizan en la PCR para sintetizar nuevas cadenas de ADN de forma muy similar a la replicación del ADN. dATP, dTTP, dGTP, dTTP son nucleótidos comunes presentes en la mezcla maestra de la PCR.
Estructura de los dNTPs:
El dNTP significa trifosfato de nucleótida desoxirribosa.
En primer lugar, tenemos que entender varias terminologías básicas como base, nucleótidos, nucleósidos, ribonucleótidos, desoxirribonucleótidos, dideoxiribonucleótidos para entender los dNTPs. Estos son algunos términos básicos utilizados rutinariamente en la genética, todavía, la gente lo entendió mal.
La Adenina y la Guanina son bases de Purina mientras que la Citosina y la Timina son bases de Pirimidina. Las bases nitrogenadas no pueden formar el ADN directamente. Para crear una molécula de ADN se requiere adicionalmente una columna vertebral de fosfato y un azúcar pentosa.
El nucleótido está formado por un azúcar pentosa, un fosfato y una base nitrogenada. Un nucleótido se une con otro nucleótido adyacente mediante un enlace fosfodiéster, mientras que un nucleótido se une con otro nucleótido de la cadena de ADN opuesta mediante enlaces de hidrógeno.
La imagen representa la estructura de la desoxirribosa trifosfato, difosfato y monofosfato.
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El fosfato presente en el nucleótido es el trifosfato, (tri- tres) cuando el fosfato no está unido al nucleótido (o está ausente), se denomina nucleósido (el nucleótido sin fosfato se denomina nucleósido).
Cuando un átomo de hidrógeno sustituye al grupo hidroxilo en el azúcar pentosa, el azúcar se denomina desoxi azúcar. El ADN está formado por el azúcar deoxi pentosa mientras que el ARN está formado por el único azúcar ribosa.
Los dNTPs son la cadena de nucleótidos formada por ribosa, base nitrogenada y fosfato.
Además, los ddNTPs son diferentes de los dNTPs.
El ddNTP trifosfato no tiene el grupo 3′ OH libre, otro grupo 3′ OH del azúcar es sustituido por hidrógeno.
De ahí que no pueda causar la expansión de una cadena de ADN en crecimiento. Así que estos tipos de ddATP, ddTTP, ddCTP y ddGTP se utilizan en la secuenciación del ADN. Discutiremos el papel de los ddNTPs en la secuenciación de forma detallada en otro artículo.
Los ddNTPs se utilizan en el método de terminación de la cadena para detener la expansión de la síntesis de ADN.
La imagen representa la diferencia entre el azúcar ribosa, el azúcar desoxirribosa y el azúcar desoxirribosa.
El trifosfato está formado por tres moléculas diferentes de fosfato que proporcionan una columna vertebral al ADN.
La columna vertebral de fosfato del ADN tiene tres moléculas de fosfato diferentes llamadas fosfato alfa, beta y gamma. Cuando se libera un fosfato o un fosfato gamma, la estructura se denomina difosfato desoxinucleotídico.
Del mismo modo, cuando se liberan dos de los tres fosfatos, la estructura se denomina monofosfato desoxinucleotídico.
El dATP y el dGTP son purinas mientras que el dCTP y el dTTP son dNTPs de pirimidina utilizados en la reacción de PCR. La función de los dNTPs en la PCR es la misma que en la replicación in vivo. Si te interesa leer las diferencias entre nucleótidos vs nucleósidos y purinas vs pirimidinas lee estos artículos:
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La imagen representa la estructura de cuatro dNTPs diferentes.
La función de los dNTPs:
Los dNTPs son los ingredientes de la PCR, RT-PCR, secuenciación de ADN o microarray de ADN que ayuda a crecer el ADN o la amplificación del ADN.
Mecanismo de acción:
El proceso de la PCR se divide en tres pasos dependientes de la temperatura:
- Denaturación
- Annealing
- Extensión.
En el paso de desnaturalización, el ADN de doble cadena se desnaturaliza en ADN de cadena simple; En el paso de recocido, el cebador se une en la posición exacta de donde está su secuencia complementaria y,
En el paso de extensión, la Taq ADN polimerasa añade los dNTPs en la cadena de ADN en crecimiento.
Una vez que la hebra se abre y el cebador se une con el ADN monocatenario, la Taq ADN polimerasa comienza su actividad catalítica.
La Taq ADN polimerasa utiliza el ADN monocatenario como sustrato para la actividad enzimática y se asienta en la unión cebador-ADN.
El extremo de la Taq ADN polimerasa se une cerca del grupo 3′ OH del cebador oligonucleótido, este complejo se denomina complejo P- ADN.
La imagen representa la estructura del ADN con enlaces de hidrógeno y el enlace fosfodiéster del ADN.
En el siguiente paso, se inicia la adición de dNTP.
El dNTP se une con el complejo P-ADN con una afinidad débil si el nucleótido complementario exacto está presente. Poco después la Taq ADN polimerasa lo sujeta y se produce la interacción de enlace de hidrógeno entre una base complementaria y el dNTP.
Aquí, al principio, no es el nucleótido completo sino la base (base nitrogenada) presente en el dNTP la que decide si se une o no.
En primer lugar, si encuentra la base complementaria en el ssDNA molde (A por T y G por C), formará los enlaces de hidrógeno entre ellos. Se fabrican tres enlaces de hidrógeno entre la C y la G y dos enlaces de hidrógeno entre la A y la T.
Una vez que se forma el enlace de hidrógeno, la Taq ADN polimerasa conforma esa unión del dNTP con la cadena de ADN en crecimiento formando un enlace fosfodiéster. Ahora, tras la formación del enlace fosfodiéster, la Taq ADN polimerasa avanza un paso más para añadir nuevos dNTP.
El enlace fosfodiéster se forma entre el 3′ OH del cebador y el 5′ P del dNTP.
Después de la formación del enlace de hidrógeno, la Taq ADN polimerasa cataliza la reacción eliminando el gamma y el beta-fosfato del trifosfato del dNTP. Tras la finalización de la reacción se liberan dos pirofosfatos (PPi).
Aún no se conoce la cinética exacta de cómo interactúan los dNTPs y la Taq polimerasa durante la reacción de PCR.
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La concentración de dNTPs en la PCR:
En general, para la reacción de PCR con 30 a 35 ciclos de una corrida, 200μM de cada dNTPs son suficientes.
200μM de cada uno, lo que significa que se utiliza un total de 800μM de 4 mezclas de dNTPs en una sola reacción de PCR. Tenemos que preparar nuestra concentración de trabajo a partir de la solución madre de 100mM.
Sin embargo, en los últimos días la mastermix lista para usar es muy popular y eficaz. La mastermix lista para usar contiene todos los ingredientes importantes como la mezcla de dNTPs, el colorante de carga del gel y la Taq ADN polimerasa.
Como somos estudiantes de ciencias tenemos que inclinarnos, cómo preparar la solución de trabajo desde el stock. Supongamos que tenemos que preparar 2mM de trabajo a partir de los 100mM de stock.
Ahora,
¿Recuerdas V1C1= V2C2? Aquí, la concentración dada C1 es 100mM (que es la concentración stock de dNTPs) V1 es el volumen dado es desconocido (?)
C2 es la concentración requerida = 2mM
V2 es el volumen requerido= 1000μL
Ahora V1C1= V2C2
V1= V2C2/ C1
V1= 1000 * 2/ 100
V1= 20μL
Aquí, 20μL de cada dNTPs necesarios para la preparación de la solución de trabajo por lo que el volumen final para nuestra mezcla es de 80μL de (dATP, dCTP, dGTP y dTTP) en 920μL de D/W.
Esto hará que la concentración final sea de 2mM de cada dNTP en 1000μL de solución de trabajo. Calcule usted mismo para 200μM.
Mi guía definitiva para utilizar los dNTPs en la PCR
Prepare siempre dos tubos de solución madre y almacene todos los tubos a -20°C.
Calcule cuántas reacciones realiza en una semana, en consecuencia, prepare la solución de trabajo del stock y almacénela a 4°C. Porque la congelación y descongelación repetida disminuirá la actividad de los dNTPs.
Lleve siempre gafas y mantenga las condiciones de esterilidad mientras prepara la solución de trabajo, porque la contaminación de ADN extraño dificultará la reacción de PCR.
La concentración de 200μM es suficiente para la reacción de PCR, sin embargo, para la PCR de largo alcance se puede utilizar una concentración de 2mM a 3 mM de cada dNTP.
A medida que la concentración de dNTPs aumenta la tasa de unión no específica se incrementará. Del mismo modo, la escasez de dNTPs conduce a productos de PCR incompletos. Por lo tanto, utilice siempre una cantidad adecuada de dNTPs.
Conclusión:
Concluyentemente, La función de los dNTPs en la reacción de PCR es tan importante como la Taq ADN polimerasa.
Con la ayuda de Taq, los dNTPs se unen a la hebra de ADN en crecimiento y la expanden. Si no quieres complicarte con todo esto, puedes utilizar un kit de PCR listo para usar que es más preferible. Sin embargo, tienes que aprender el método manual de preparación de reactivos.